Reakcji łańcuchowej polimerazy ( PCR ), lub reakcji łańcuchowej polimerazy , ogólnie Sigle PCR (z angielskiego : reakcji łańcuchowej polimerazy ) lub amplifikacji badania kwas nukleinowy (NAT francuski Kanada) jest metodą biologii molekularnej amplifikacji genu in vitro .
Umożliwia duplikowanie w dużej liczbie (z mnożnikiem rzędu miliarda) znanej sekwencji DNA lub RNA , z niewielkiej ilości (rzędu kilku pikogramów) kwasu nukleotydowego ( określona sekwencja DNA ( amplikon )) i specyficzne startery składający się z syntetycznych oligonukleotydów, o dwudziestu do dwudziestu pięciu nukleotydów. Możemy dzięki temu np. wykryć obecność wirusa HIV lub zmierzyć miano wirusa (stężenie wirusa w osoczu), ślady GMO (organizmy modyfikowane genetycznie), czy wirusy zapalenia wątroby typu B, C i D.
Coraz częściej stosowany w kryminalistyce , technika ta opiera się na połączeniu dwóch czynników:
Pierwiastki te umożliwiają kontrolowanie aktywności enzymatycznej dzięki przemianom temperaturowym (dostarczanym przez termocykler ) powtarzanym cyklicznie (por. reakcja łańcuchowa ).
Pierwsze zastosowane polimerazy DNA pochodziły z bakterii termofilnych (odpornych na bardzo wysokie temperatury), na przykład Thermus aquaticus ( polimeraza Taq ) lub nawet Pyrococcus furiosus (polimeraza Pfu), Thermococcus litoralis (polimeraza Vent lub Tli), Thermus thermophilus (polimeraza Tth) . Obecnie o stosowanych enzymach mówi się, że są rekombinowane , co znacznie upraszcza ich produkcję, a ich właściwości zostały szeroko zmodyfikowane, aby były wydajniejsze i bardziej wierne.
W ciągu niespełna dziesięciu lat nauczyliśmy się wykonywać ponad miliard kopii w mniej niż godzinę, co narzuciło PCR w laboratoriach, rewolucjonizując biologię molekularną. Jednak jest zawodna w przypadku niektórych źródeł próbek ( mocz , plwocina ), prawdopodobnie z powodu inhibitorów polimerazy Taq .
PCR to technologia, która zrewolucjonizowała biologię molekularną i bardzo szybko zadomowiła się w laboratoriach. W przeciwieństwie do tego, metoda real-time PCR musiała poczekać na wprowadzenie na rynek szeregu innowacji technologicznych, zanim się rozwinęła i nadal jest uważana za nową metodologię. Liczba artykułów w ciągu roku odpowiadających na słowa kluczowe „ reakcja łańcuchowa polimerazy ” (1) oraz „ reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym ” (2) w wyszukiwarce PubMed daje dość dobre wyobrażenie o ich znaczeniu w świecie naukowym. Zauważ, że metoda nie jest wolna od błędów, na przykład niektóre artykuły zostały znalezione dla PCR w czasie rzeczywistym w 1991 i 1992 (linia przerywana), podczas gdy jej zasada została opisana dopiero w 1993. Różnica (1 -2) jest reprezentatywna dla wagi z końcowego PCR , która będzie prawdopodobnie stopniowo ustępują czasie rzeczywistym.
Ta technika znacznie się rozwinęła od samego początku. Wśród najbardziej fundamentalnych zmian znajdujemy:
Dla jasności podane daty odpowiadają pierwszej publikacji z tej dziedziny i przytaczane są tylko pierwsi autorzy, przy czym pełne odnośniki znajdują się w rozdziale „Bibliografia”. Wybór ten pozwala również ograniczyć kontrowersje, takie jak rola Rosalind Elsie Franklin w odkryciu struktury podwójnej helisy DNA.
PCR to technika oparta na powtarzaniu cykli zmiany temperatury. Z wyjątkiem pewnych metodologii (np. zastosowanie sond hydrolizy), każdy cykl zawiera trzy etapy wyszczególnione poniżej. Ze względu na dydaktykę rozważymy dla poniższego przykładu wydajność PCR wynoszącą 100%.
Ten etap jest zwykle wykonywany w temperaturze pokojowej. Dwuniciowy DNA przyjmuje konformację podwójnej helisy. W tym przykładzie rozważymy, że w roztworze znajduje się tylko jedna początkowa dwuniciowa cząsteczka DNA, kolorowy obszar (różowy i pomarańczowy) odpowiadający naszemu amplikonowi. Uwaga: komplementarne DNA powstałe w wyniku odwrotnej transkrypcji są zazwyczaj jednoniciowe, a następnie przyjmą złożone trójwymiarowe konformacje podobne do RNA.
Początkowa denaturacja (1' na schemacie)Przed rozpoczęciem właściwych cykli PCR przeprowadza się etap ogrzewania (zwykle 10 do 15 minut w 95 °C ). Ten etap umożliwia: dehybrydyzację dwuniciowych DNA, rozbicie struktur drugorzędowych, homogenizację medium reakcyjnego przez mieszanie termiczne, aktywację polimeraz typu „Hot start”, denaturację innych enzymów, które mogą znajdować się w roztworze ( Odwrotna transkryptaza, N-glikozylaza uracylowa).
Faza denaturacji (1 na schemacie)Ten etap (zwykle od 0 do 1 minuty w 95 °C ) umożliwia dehybrydyzację DNA, „odłączenie” polimeraz, które nadal byłyby związane z matrycą i homogenizację ośrodka reakcji.
Faza hybrydyzacji lub parowania starterów (2 na schemacie)Ten etap (zazwyczaj 2 do 60 sekund w 56 - 64 ° C ) umożliwia hybrydyzację starterów sensownych i antysensownych z matrycowymi DNA dzięki temperaturze, która jest im termodynamicznie korzystna. Niewiele z matrycowych nici DNA może hybrydyzować (związać się) z ich nicią komplementarną, co zapobiegałoby wiązaniu starterów, ponieważ startery są znacznie krótsze iw znacznie wyższym stężeniu. Doświadczalnie obserwuje się, że PCR działa nawet w fazie hybrydyzacji z temperaturą o kilka stopni wyższą niż teoretyczna Tm starterów, prawdopodobnie dlatego, że już oddziałują z polimerazami, które ustabilizowałyby ich hybrydyzację z matrycowym DNA.
Charakterystyka podkładówTen etap (zwykle 4 do 120 sekund w temperaturze 72 °C ) umożliwia polimerazom syntezę komplementarnej nici ich matrycowego DNA w optymalnej dla nich temperaturze. Ta nić jest wykonana z wolnych dNTP obecnych w medium reakcyjnym. Czas trwania tego etapu zwykle zależy od długości amplikonu.
Pod koniec etapu 3 mamy wtedy dwie nici matrycowego DNA i dwie nici (jedna sensowna i jedna antysensowna) DNA precyzyjnie zdefiniowane tylko na ich końcu 5'.
Cykl n O 2Trzy fazy postępować w taki sam sposób, jak w cyklu n O 1 z tym, że dwa polimerazy, które dotarły do końca swojej matrycy DNA oddziela się spontanicznie. Pod koniec fazy 3 otrzymujemy wszystkie rodzaje DNA, które będą istniały podczas PCR, a mianowicie:
Tak samo dla cyklu 2. Pod koniec fazy 3 obserwujemy 1 nić typu A i F, 3 B i D oraz 4 C i E. Obserwujemy pojawienie się dwóch dwuniciowych cząsteczek DNA CE, co odpowiada do naszego amplikonu.
Cykl n O 4To samo dla cyklu 3. Pod koniec fazy 4 obserwujemy 1 nić typu A i F, 4 B i D oraz 11 C i E. Obserwujemy, że amplikon staje się kombinacją większościową.
Cykle n O 5 i rejonachGdybyśmy zwiększyli liczbę cykli, otrzymalibyśmy następującą tabelę:
cykle | ||||||||||||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | nie | ||
rodzaj cząsteczek | DO | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | |
b | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | ||
VS | 0 | 0 | 1 | 4 | 11 | 26 | 57 | 120 | 247 | 502 | 1013 | 2036 | 4083 | 8178 | 16369 | 32752 | ||
D | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | ||
mi | 0 | 0 | 1 | 4 | 11 | 26 | 57 | 120 | 247 | 502 | 1013 | 2036 | 4083 | 8178 | 16369 | 32752 | ||
F | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | ||
pojedyncza nić | numer | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256 | 512 | 1024 | 2048 | 4096 | 8192 | 16384 | 32768 | 65536 | A n do F n |
% amplikonu | 0,00 | 0,00 | 25,00 | 50,00 | 68,75 | 81,25 | 89,06 | 93,75 | 96,48 | 98.05 | 98,93 | 99,41 | 99,68 | 99,83 | 99,91 | 99,95 | ||
podwójna nić | numer | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256 | 512 | 1024 | 2048 | 4096 | 8192 | 16384 | 32768 | |
% amplikonu | 0,00 | 0,00 | 0,00 | 12.50 | 43,75 | 65,63 | 79,69 | 88,28 | 93,36 | 96,29 | 97,95 | 98,88 | 99,39 | 99,67 | 99,82 | 99,91 |
gdzie A n (B n itd.) jest liczbą cząsteczek typu A (B itd.) obecnych po n- tym cyklu.
Analizując tę tabelę, stwierdzamy, że:
Wartości te uzyskano zaczynając od pojedynczej początkowej cząsteczki dwuniciowego DNA, ale poza tym każda matryca przeszłaby ten sam proces. W danym cyklu ilość DNA zależy zatem od początkowej liczby matryc. Z drugiej strony, niezależnie od początkowego stężenia, teoretycznie możliwe jest uzyskanie dowolnej ilości poprzez dostosowanie liczby cykli. PCR podlega zatem teoretycznie prawu:
Ale PCR to złożona reakcja enzymatyczna. Produkt jest identyczny z substratem i może zahamować działanie enzymu, ale przede wszystkim może zacząć brakować odczynników wtórnych (startery, dNTP). W związku z tym PCR może mieć tylko wykładnicze prawo amplifikacji, o ile matryca DNA jest jedynym czynnikiem ograniczającym . Reakcja staje się wtedy nieprzewidywalna i niemożliwe jest porównanie ze sobą kilku próbek bez mniej lub bardziej znaczącego błędu ilościowego (patrz artykuł na temat ilościowego PCR ). Dlatego ważne jest zrozumienie różnych faz kinetyki PCR.
W tym rozdziale omówiono mierzalną kinetykę PCR, ponieważ ograniczenia technologiczne sprawiają, że wczesne cykle i generalnie duża część wykładniczej części są niedostępne. Jego pozorny (mierzalny) profil przyjmuje kilka odrębnych faz, mniej lub bardziej rozwiniętych zgodnie z wyborami metodologicznymi.
Uwaga : Według autorów termin skuteczność może mieć dwa znaczenia:
Wnioski wyciągnięte z tych dwóch pojęć (które można wywnioskować bezpośrednio z siebie) są absolutnie identyczne; w dalszej dyskusji zachowamy pierwszą definicję, większość. Ta wydajność PCR jest podstawowym elementem, który należy wziąć pod uwagę podczas uzyskiwania pomiaru ilościowego lub ustanawiania protokołu multipleksowej PCR, ale generalnie jest nieistotna w przypadku wyniku jakościowego lub końcowego PCR .
W przypadku idealnego cyklu teoretycznego każda nić matrycy daje jedną i tylko jedną kompletną kopię amplikonu. Całkowita liczba nici podwaja się zatem na każdym etapie, a teoretyczna wydajność reakcji PCR (oznaczona jako E ) jest w tym przypadku dokładnie równa dwóm. Na wykresie przedstawiającym wynik w skali półlogarytmicznej powoduje to, że nachylenie części prostoliniowej odpowiada idealnemu postępowi log (2) na cykl (tj. około 3 decybeli na cykl).
Pojawienie się PCR w czasie rzeczywistym podkreśliło, że rzeczywista wydajność reakcji nie zawsze była równa dwa. Oznacza to, że wszystkie cykle rozważanych ilościowy (obszar n o 6 kinetyki) w rzeczywistych warunkach replikacji, nić może nie dać kopiowania i pojedyncze. Na wykresie wzorca półlogarytmicznego skutkuje to nachyleniem prawej strony, które różni się od oczekiwanego i generalnie jest mniej strome. Nachylenie doświadczalne jest mierzalne i daje eksperymentalną wartość E . Fakt, że ta część jest prosta, oznacza, że w tym przedziale stężeń średnia liczba kopii wytwarzanych przez nić jest stała z jednego cyklu na drugi (a w szczególności nie zależy od stężeń). Ale nie ma w tym przypadku „jednego egzemplarza i tylko jeden na nić”, ale inna liczba.
Większość protokołów eksperymentalnych podaje wydajność PCR między 1,75 a 2. Dwa zjawiska są głównymi przyczynami i prowadzą do wydajności eksperymentalnej mniejszej lub równej dwóm, ponieważ reakcje biochemiczne nie zawsze są całkowite, niektóre replikacje zawodzą w rzeczywistych eksperymentach warunki:
Z drugiej strony, niektóre źródła uważają, że może być również większa niż dwa (co zakłada, że nić ma znaczące prawdopodobieństwo wykonania dwóch lub więcej syntez podczas cyklu) i byłaby akceptowalna do 2,3. Można to wyjaśnić na dwa sposoby:
Następnie zderzają się dwie szkoły, popierając argumenty eksperymentalne. Uważa się, że ta wydajność jest stała dla każdego amplikonu w danym protokole doświadczalnym. Drugi uważa, że zawsze znacznie się różni i że musi być stale mierzony ponownie. Należy zauważyć, że bardzo trudno jest stwierdzić, czy zmienność obserwowanej wydajności PCR wynika z samej natury tej metody, zmienności w protokole doświadczalnym (brak odtwarzalności odczynników lub postępowania) lub zmienności danych akwizycja (zmienność fluorescencji, różne kanały odczytu, odchylenie w analizie matematycznej). Bardzo trudno jest również mieć pewność, że zastosowana wydajność (mierzona w każdym eksperymencie lub nie) jest rzeczywiście tą, która miała miejsce w próbce, która ma być kalibrowana (patrz ilościowy PCR ).
Akronimy i nazwy w języku angielskim podano w nawiasach.
Multiplex PCR ( multiplex PCR ) jest protokołem amplifikacji więcej niż jednego amplikonu na raz, przy użyciu co najmniej trzech starterów reakcji PCR. Produkty PCR będą wówczas konkurować jedynie z polimerazą, dNTP i, opcjonalnie, markerem DNA. Możliwa jest również amplifikacja różnych typów DNA rozpoznawanych przez tę samą parę starterów, takich jak naśladownictwo. Multipleksową reakcję PCR można przeprowadzić w punkcie końcowym (produkty PCR zwykle różnią się wielkością lub obecnością miejsca restrykcyjnego) lub w czasie rzeczywistym (każdy produkt jest mierzony przez konkretną sondę sprzężoną z fluoroforem, którego widmo emisji różni się od inni). Jego zastosowania jakościowe są liczne (wykrywanie szczepów wirusów, mutacji itp.), ale jego aspekt ilościowy nie jest jednomyślny, pomimo silnej presji przemysłowej na ten bardzo lukratywny rynek.
Meta-PCR jest metodą, która umożliwia otrzymanie syntetycznej cząsteczki DNA zawierającej dowolną kombinację DNA amplifikowanego przez PCR w dowolnej kolejności. Przeprowadza się ją w jednej probówce i składa się z dwóch różnych etapów PCR oddzielonych cyklem rozmrażania w celu usunięcia resztkowej aktywności polimerazy. Meta-PCR można wykorzystać do zwiększenia przepustowości skanowania mutacji i metod skanowania.
Zagnieżdżonych PCR , PCR lub uchwyt zagnieżdżony PCR ( nested PCR ) jest techniką PCR w dwóch kolejnych etapach, w dwóch różnych par starterów wiążące sekwencje znajdujące się w pierwszej amplikonu sekund. Ta technika została początkowo zastosowana w celu zmniejszenia ryzyka zanieczyszczenia (produkt końcowy musiał być w stanie oddziaływać z dwiema parami starterów, a więc z dwoma poziomami specyficzności). Obecnie jest szeroko stosowany przez wirusologów pracujących nad wirusami RNA, które mogą mieć wysoką mutację. Pierwsza para starterów została zaprojektowana tak, aby móc zaczepić kilka stabilnych części genomu wirusowego, a druga do identyfikacji podtypu. Pozwala również na lepszą czułość wyniku.
Jest to amplifikacja PCR w obecności niewielkiej ilości jednego ze starterów. Umożliwia bezpośrednie sekwencjonowanie amplifikowanych fragmentów. Podczas pierwszych 20 do 25 cykli, dwuniciowy DNA jest generowany, aż do wyczerpania startera ograniczającego, a jednoniciowy DNA jest wytwarzany podczas ostatnich 5 do 10 cykli. Stosowane proporcje starterów wynoszą 50 pmol/1-5 pmoli/100 µl (1-3 pmoli jednoniciowej po 30 cyklach).
Thermal asymmetric interlaced PCR ( TAIL-PCR lub Thermal asymmetric interlaced PCR ) jest złożonym protokołem łączącym zasady nested PCR, asymetrycznej PCR przez Tm starterów, następstwo kilku typów cykli sprzyjających hybrydyzacji takiego a takiego startera i zdegenerowane startery. Celem jest uzyskanie końcowego amplikonu specyficznego dla sekwencji DNA, której tylko jeden koniec jest ogólnie znany, w celu zsekwencjonowania nieznanej części. Metoda ta jest szeroko stosowana do chodzenia po chromosomach lub charakteryzowania zmiennych sekwencji immunoglobulin.
Jest to technika pomagająca w opracowaniu nowego protokołu PCR. Wymaga termocyklerów zdolnych do zapewnienia różnych temperatur na tym samym etapie dla różnych próbek. Stosowany jest głównie do optymalizacji etapu hybrydyzacji, w szczególności w multipleksowym PCR.
PCR półilościowe opiera się na przerwaniu reakcji PCR w kilku cykli odpowiednich do fazy stacjonarnej (ilość DNA rośnie bardzo wolno, ponieważ istnieje niewiele matrycowego DNA), faza wykładnicza (szybki wzrost), i na plateau (zmniejszenie w ilości odczynników). W przypadku próbki możliwe jest oszacowanie początkowej ilości DNA, jeśli istnieje próbka, której ilość DNA jest znana (standard). Ich amplifikacji metodą PCR, z zatrzymywaniem reakcji w 20 ty i 30 -tego cyklu PCR i porównanie intensywności światła produktów PCR znakowaną BET można oszacować początkową ilość DNA. W przypadku dwóch próbek możliwe jest porównanie ich początkowej ilości DNA poprzez zatrzymanie PCR przed osiągnięciem plateau PCR (<30 cykli).
PCR w czasie rzeczywistym lub ilościowa PCRPCR w czasie rzeczywistym ( real-time PCR ) rewolucja w wykorzystaniu PCR, technika ta polega na pomiarze spolimeryzowany ilości DNA w każdym cyklu (w czasie rzeczywistym) ze znacznikiem fluorescencyjnym . Pozwala z zasady na dokonywanie pomiarów ilościowych (wyjaśniając nazwę ilościowy PCR, qPCR ), ale wymaga specjalnych termocyklerów . Nie należy go mylić z RT-PCR ( Reverse Transcription PCR ), dlatego preferujemy nazwy ilościowe PCR lub qPCR . Niektóre eksperymenty w konkurencyjnej PCR lub radioaktywnej PCR umożliwiają uzyskanie użytecznych pomiarów ilościowych.
Punkt końcowy PCRPunkt końcowy PCR ( end-point PCR ) to termin , który pojawił się w opozycji do PCR w czasie rzeczywistym . Odnosi się do wszystkich prób kwantyfikacji produktu końcowego reakcji PCR.
Reakcja łańcuchowa polimerazy przyłożenie ( touchdown PCR ) jest protokół stosowany do amplifikacji DNA słabo reprezentowanej i / lub poddawanych konkurencji z ich starterów przez pseudo produktów genowych. Polega na utrzymywaniu bardzo wysokiej temperatury hybrydyzacji podczas pierwszych cykli w celu zapewnienia wysokiej rygorystyczności, a tym samym specyficznej amplifikacji. Gdy sekwencja będąca przedmiotem zainteresowania staje się większością w stosunku do swoich konkurentów, temperatura hybrydyzacji jest stopniowo obniżana w celu zapewnienia lepszej wydajności PCR. Wydajność nie jest stała podczas całej reakcji, do tej pory nie jest możliwe uzyskanie wyniku ilościowego bez błędu systematycznego.
Kolonia PCR ( Colony PCR ) to protokół do amplifikacji w prosty sposób DNA mikroorganizmów (bakterii, archeonów lub drożdży) przez bezpośrednie zaszczepienie kolonii w mieszaninie reakcyjnej PCR. Podczas pierwszych etapów denaturacji komórki ulegają lizie, a ich DNA jest uwalniane do pożywki reakcyjnej. Uwolnione w ten sposób DNA może następnie służyć jako matryca.
Kolonia PCR jest stosowana w szczególności do weryfikacji wydajności transgenezy. Był szeroko stosowany podczas konstruowania BAC w dużych programach sekwencjonowania .
Kolonia PCR jest szeroko stosowana w badaniach mikrobiologicznych w celu filogenetycznego scharakteryzowania badanych szczepów.
ep-PCR umożliwia wprowadzenie błędów do sekwencji kopiowanej przez polimerazę. Technikę tę można wykorzystać na przykład do stworzenia dużej liczby mutantów, które następnie zostaną wybrane (ewolucja ukierunkowana). Polimerazę użytą (polimeraza Taq jest oczywiście mniejsza niż w przypadku konwencjonalnych wierny polimerazy PCR) oraz szczególnych warunkach (wysokie stężenia MgCl 2 lub dodanie MnCl 2 ) pozwalają na zwiększenie liczby błędów.
RT-PCR ( reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją ) to technika, która łączy odwrotną transkrypcję (RT), a następnie PCR. Syntetyzuje komplementarną nić RNA z deoksyrybonukleotydami przy użyciu zależnej od RNA polimerazy DNA ( odwrotnej transkryptazy ). Ten cDNA jest ogólnie przeznaczony do amplifikacji przez PCR (cDNA jest bardziej stabilny, daje większą swobodę niż RNA w następujących analizach).
Przydatność: służy do diagnozy klinicznej poprzez pomiary ilościowe metodą PCR w czasie rzeczywistym (badanie miana wirusa w wirusach RNA) oraz poprzez pomiary jakościowe (analiza produktu ekspresji genów). Może również ułatwić sekwencjonowanie dużych genów.
Odwrotna transkrypcja pozostaje delikatna (niska powtarzalność; kruchość RNA, częste zanieczyszczenie DNA. Czasami konieczna jest swoista amplifikacja (jeśli podłoże zawiera sekwencje homologiczne w ilościach znacznie większych niż sekwencja będąca przedmiotem zainteresowania). Wybór starterów do PCR i zgodność ze standardami wewnętrznymi lub zewnętrznymi ma często duże znaczenie.
Jednoetapowy RT-PCREtap RT-PCR a ( jednoetapowy RT-PCR ) to protokół mieszania reagentów RT i PCR, dzięki czemu oba etapy można wykonać bez konieczności otwierania probówki. Umożliwia to zmniejszenie ryzyka zanieczyszczenia lub odwrócenia próbki, ale trudniej jest zoptymalizować środowisko reakcji na każdym etapie. To dodatkowo wywołuje ryzyko błędu systematycznego normalizacji etapu RT, ponieważ obejmuje on stosowanie multipleksowej reakcji PCR.
RT-PCR na miejscuRT-PCR in situ jest metodologią polegającą na przeprowadzeniu RT-PCR nie na cząsteczkach w roztworze, ale na skrawkach histologicznych. Chociaż wyniki są tylko półilościowe, dostarczają również informacji o lokalizacji transkryptów w tkance.
Ilościowy RT-PCRIlościowa RT-PCR (qRT-PCR) jest techniką, aby móc ocenić typu RNA pierwotnie obecnej w próbce. Termin ten oznacza zastosowanie dwóch następujących po sobie technik, odwrotnej transkrypcji, a następnie PCR w czasie rzeczywistym. Głównym celem większości biologów jest to, że budzi żywe kontrowersje co do użycia zewnętrznego lub wewnętrznego kalibratora (genu domowego). Z wyjątkiem skomplikowanych protokołów wykorzystujących konkurencyjne homologiczne kalibratory zewnętrzne, umożliwia tylko względną ocenę ilościową.
RT-PCR na komórceRT-PCR pojedynczych komórek (ang. single cell RT-PCR ) jest metodologią stosowaną do badania transkryptów pojedynczej komórki, uzyskanych za pomocą patch-clamp, mikrodysekcji laserowej lub sortowania komórek na podstawie aktywności fluorescencyjnej (FACS w języku angielskim oznacza sortowanie komórek aktywowane fluorescencyjnie ). Ta precyzja może być konieczna, gdy tkanka nie jest jednorodna (komórki nowotworowe, dobrze zróżnicowane warstwy komórek itp.), ale ocena ilościowa stanie się mniej dokładna z powodu wzmocnienia efektów stochastycznych i dlatego wymaga zwielokrotnienia pomiarów.
Inna technika amplifikacji izotermicznej: „polimeryzacja kwasów nukleinowych w celu kontrolowanej apoptozy”. Autorzy twierdzą, że tę technikę można by zastosować w żywych komórkach, a tym samym leczyć różne patologie (HIV, malaria, nowotwory itp.), ale te twierdzenia nie zostały na razie potwierdzone przez żaden inny zespół.
TP-PCR (TP oznacza Triplet Repeat primed ), złożony wariant PCR, został opracowany przez Jona Warnera w 1996 roku i jest stosowany w amplifikacji genów z powtórzonymi tripletami, jak w przypadku dystrofii miotonicznej przez Steinerta . W tych przypadkach nie można zastosować kombinacji PCR-sekwencjonowanie, ponieważ polimeraza Taq powoduje błędy replikacji.
Helikazy zależne amplifikacji ( helikaza zależne amplifikacji , HDA ) jest nowym techniką PCR w pobliżu temperatury, w której dehybridization wywołanego dostarczonych przez helikazy.
PCR pozwala na szybką i wysoce specyficzną diagnozę chorób zakaźnych wywoływanych przez bakterie lub wirusy. PCR umożliwia również identyfikację mikroorganizmów nienadających się do hodowli lub wolno rosnących, takich jak prątki , bakterie beztlenowe lub wirusy na podstawie testów kultur tkankowych i modeli zwierzęcych. Podstawą zastosowań diagnostycznych PCR w mikrobiologii jest wykrywanie czynników zakaźnych i odróżnienie szczepów niepatogennych od szczepów patogennych na podstawie określonych genów.
Charakterystyka i wykrywanie organizmów zakaźnych zostały zrewolucjonizowane przez PCR w następujący sposób:
Ludzki wirus niedoboru odporności (lub HIV ) jest trudnym celem do znalezienia i zwalczenia. Pierwsze testy na infekcję opierały się na obecności przeciwciał przeciwko wirusowi w krwiobiegu. Jednak przeciwciała pojawiają się dopiero kilka tygodni po zakażeniu, przeciwciała matczyne maskują infekcję noworodka, a środki lecznicze do zwalczania infekcji nie wpływają na przeciwciała. Testy PCR zostały opracowane, aby móc wykryć niskie miano wirusa rzędu jednego genomu wirusa wśród DNA ponad 50 000 komórek gospodarza. Zakażenia można wykryć wcześniej, oddaną krew można bezpośrednio przebadać pod kątem wirusa, noworodki można natychmiast przetestować pod kątem zakażenia, a efekty leczenia przeciwwirusowego można określić ilościowo.
Niektóre drobnoustroje chorobotwórcze, takie jak gruźlica , są trudne do pobrania od pacjentów i rozwijają się powoli w laboratorium. Testy oparte na PCR mogą wykryć niewielką liczbę organizmów chorobotwórczych (żywych lub martwych) w próbkach. Szczegółową analizę genetyczną można również wykorzystać do wykrycia oporności na antybiotyki, umożliwiając natychmiastowe i skuteczne leczenie. Skutki antybiotykoterapii można również ocenić natychmiast.
Rozprzestrzenianie się organizmu chorobotwórczego przez populacje zwierząt domowych lub dzikich można monitorować za pomocą testów PCR. W wielu przypadkach można wykryć i monitorować pojawienie się nowych zjadliwych podtypów. Podtypy organizmu, które były odpowiedzialne za poprzednie epidemie, można również określić za pomocą PCR.
Wirusowe DNA można wykryć metodą PCR. Stosowane startery powinny być specyficzne dla sekwencji docelowych w DNA wirusa, a PCR można stosować do testów diagnostycznych lub sekwencjonowania DNA genomu wirusa. Wysoka czułość PCR pozwala na wykrycie wirusa wkrótce po zakażeniu, a nawet przed wystąpieniem objawów choroby. Takie wczesne wykrycie może dać lekarzom szerszy wybór leczenia. Ilość wirusa ( miano wirusa ) u pacjenta można również określić ilościowo technikami ilościowego oznaczenia DNA opartymi na PCR. Na przykład do wykrywania wirusowego genomu choroby koronawirusowej 2019 stosuje się wariant PCR (RT-PCR) .
Choroby takie jak krztusiec wywoływane są przez bakterie Bordetella pertussis. Bakteria ta powoduje poważną ostrą infekcję dróg oddechowych, która dotyka różne zwierzęta i ludzi i powoduje śmierć wielu małych dzieci. Toksyna krztuśca jest egzotoksyną białkową, która wiąże się z receptorami komórkowymi przez dwa dimery i reaguje z różnymi typami komórek, takimi jak limfocyty T, które odgrywają rolę w odporności komórkowej. PCR jest ważnym narzędziem testowym, które może wykryć sekwencje w genie toksyny krztuśca. Ponieważ PCR ma wysoką czułość na toksyny i szybki czas realizacji, jest bardzo skuteczny w diagnozowaniu krztuśca w porównaniu z hodowlą.