Amplifikacja za porednictwem ptli izotermicznej



Informacje, które udało nam się zgromadzić na temat Amplifikacja za porednictwem ptli izotermicznej, zostały starannie sprawdzone i uporządkowane, aby były jak najbardziej przydatne. Prawdopodobnie trafiłeś tutaj, aby dowiedzieć się więcej na temat Amplifikacja za porednictwem ptli izotermicznej. W Internecie łatwo zgubić się w gąszczu stron, które mówią o Amplifikacja za porednictwem ptli izotermicznej, a jednocześnie nie podają tego, co chcemy wiedzieć o Amplifikacja za porednictwem ptli izotermicznej. Mamy nadzieję, że dasz nam znać w komentarzach, czy podoba Ci się to, co przeczytałeś o Amplifikacja za porednictwem ptli izotermicznej poniżej. Jeśli informacje o Amplifikacja za porednictwem ptli izotermicznej, które podajemy, nie są tym, czego szukałeś, daj nam znać, abyśmy mogli codziennie ulepszać tę stronę.

.


Amplifikacji izotermicznej za porednictwem ptli ( LAMP ) jest technik pojedynczego Rura do amplifikacji DNA i niedrog alternatyw do wykrywania niektórych chorób. Izotermiczna amplifikacja za porednictwem ptli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP) czy LAMP z etapem odwrotnej transkrypcji, aby umoliwi detekcj RNA.

LAMP to technika izotermicznej amplifikacji kwasów nukleinowych. W przeciwiestwie do technologii reakcji acuchowej polimerazy (PCR), w której reakcja jest przeprowadzana w serii etapów lub cykli naprzemiennych temperatur, amplifikacja izotermiczna (tj. w staej temperaturze) nie wymaga termocyklera .

Techniczny

W LAMP sekwencja docelowa jest amplifikowana w staej temperaturze 60-65°C przy uyciu dwóch lub trzech zestawów starterów i polimerazy o wysokiej aktywnoci wypierania nici oprócz aktywnoci replikacyjnej. Zwykle do amplifikacji 6 rónych regionów na genie docelowym stosuje si 4 róne startery, co zwiksza specyficzno: dwa zewntrzne startery (F3 i B3) i dwa wewntrzne podwójne startery (FIB i BIP). Dodatkowa para starterów ptli moe jeszcze bardziej przyspieszy reakcj. Kade dziaanie polimerazy DNA polega na przemieszczeniu nici i tworzeniu ptli od pocztku do koca amplifikacji. W cyklach polimerazy uzyskuje si coraz dusze zygzakowate czsteczki. Otrzymane czsteczki maj wtedy inne sekwencje ni te na pocztku, ale dua ilo DNA jest amplifikowana z niewielkiej iloci materiau.

Gdy podczas amplifikacji dodawany jest nukleotyd, uwalniany jest pirofosforan magnezu. Uwaa si, e uwolniona ilo jest tak dua, e pirofosforany wytrcaj si i tworz widoczne goym okiem zmtnienie probówki zawierajcej próbk. Ilo DNA wytworzonego w LAMP jest znacznie wysza ni amplifikacja oparta na PCR , w rzeczywistoci w cigu 30 do 60 minut mamy amplifikacj o wspóczynniku 10 10 , dlatego bardzo wane.

Produkt amplifikacji mona wykry fotometrycznie , mierzc zmtnienie spowodowane przez osad pirofosforanu magnezu w roztworze jako produkt uboczny amplifikacji. W ten sposób moliwe jest uzyskanie atwej wizualizacji goym okiem lub za pomoc prostych metod wykrywania fotometrycznego dla maych objtoci. Reakcj mona ledzi w czasie rzeczywistym, mierzc zmtnienie lub fluorescencj przy uyciu barwników interkalujcych, takich jak SYTO 9. Barwniki, takie jak ziele SYBR, mog by uywane jako kolorowy wskanik, dziki czemu mona go zobaczy goym okiem bez potrzeby korzystania z drogiego sprztu lub odpowied, któr mona dokadniej zmierzy za pomoc oprzyrzdowania.

Metoda LAMP moe by równie ilociowa, poniewa czsteczki barwnika bezporednio interkaluj lub znakuj DNA i mog z kolei by skorelowane z liczb pocztkowo obecnych kopii. Wykrycie amplifikacji DNA w probówce jest moliwe przy uyciu kalcyny obcionej manganem, która zaczyna emitowa wiato ( fluorescencj ) po skompleksowaniu manganu przez pirofosforan podczas syntezy manganu in vitro.DNA. Ponadto, wizualne wykrywanie amplikonów LAMP goym okiem oparto na ich zdolnoci do hybrydyzacji z komplementarnym ssDNA zwizanym ze zotem, a tym samym zapobieganie normalnej zmianie koloru z czerwonego na fioletowo-niebieski, która w przeciwnym razie wystpiaby w wyniku indukowanej sol agregacji drobinki zota. Tak wic metoda LAMP poczona z wykrywaniem amplikonu przez AuNP ma przewag nad innymi wczeniejszymi metodami pod wzgldem skrócenia czasu badania, potwierdzania amplikonu przez hybrydyzacj i stosowania prostszego sprztu (tj. bez koniecznoci stosowania termocyklera , sprztu do elektroforezy lub transiluminatora UV .

Zastosowania i korzyci

LAMP to stosunkowo nowa technika amplifikacji DNA, która ze wzgldu na swoj prostot, solidno i niski koszt moe oferowa znaczne korzyci. LAMP moe by stosowany przez klinicystów jako proste badanie przesiewowe w terenie lub w punkcie opieki. Poniewa LAMP jest izotermiczna, co eliminuje konieczno stosowania drogich termocyklerów stosowanych w konwencjonalnym PCR, moe by szczególnie uyteczn metod diagnozowania chorób zakanych w krajach o niskich dochodach. LAMP jest intensywnie badany pod ktem wykrywania chorób zakanych, takich jak grulica, malaria i piczka. W regionach rozwijajcych si nie zostaa jeszcze w peni zwalidowana pod ktem innych powszechnych patogenów.

Zaobserwowano, e LAMP jest mniej wraliwa ni PCR na inhibitory w zoonych próbkach, takich jak krew, prawdopodobnie z powodu zastosowania innej polimerazy DNA (zwykle Bst - Bacillus stearothermophilus - polimeraza DNA zamiast polimerazy Taq jak w PCR). Kilka raportów opisuje skuteczne wykrywanie patogenów z minimalnie przetworzonych próbek, takich jak krew poddana obróbce cieplnej lub w obecnoci matryc próbek klinicznych. Ta oporno na LAMP moe by uyteczna w warunkach niskich zasobów lub w terenie, gdzie konwencjonalna ekstrakcja DNA lub RNA przed testami diagnostycznymi moe nie by moliwa.

Limity

LAMP jest mniej wszechstronna ni PCR, najbardziej znana technika amplifikacji kwasów nukleinowych. LAMP jest przydatna przede wszystkim jako technika diagnostyczna lub detekcyjna, ale nie jest przydatna do klonowania lub niezliczonych innych zastosowa biologii molekularnej moliwych przez PCR. Poniewa LAMP uywa 4 (lub 6) starterów ukierunkowanych na 6 (lub 8) regionów w do maym segmencie genomu i poniewa projektowanie starterów podlega wielu ograniczeniom, trudno jest zaprojektowa zestawy starterów dla LAMP do oka. Do pomocy w projektowaniu starterów LAMP zazwyczaj stosuje si bezpatne, otwarte lub komercyjne oprogramowanie, chocia ograniczenia w projektowaniu starterów oznaczaj, e wybór miejsca docelowego jest mniejszy ni w przypadku PCR.

W zastosowaniu diagnostycznym musi to by zrównowaone potrzeb wyboru odpowiedniego celu (np. miejsca konserwowanego w wysoce zmiennym genomie wirusa lub celu, który jest specyficzny dla konkretnego szczepu patogenu). Kilka zdegenerowanych sekwencji moe by koniecznych, aby obj róne warianty szczepów tego samego gatunku. Jednak posiadanie takiej mieszaniny starterów moe prowadzi do niespecyficznej amplifikacji w pónej amplifikacji.

Podejcia multipleksowania dla LAMP s mniej rozwinite ni dla PCR. Wiksza liczba starterów na cel w LAMP zwiksza prawdopodobiestwo interakcji starter-starter dla multipleksowanych zestawów celów. Produkt LAMP jest seri konkatamerów regionu docelowego, co skutkuje charakterystyczn drabink lub wzorem prków na elu, a nie pojedynczym prkiem, jak w przypadku PCR. Chocia nie stanowi to problemu przy wykrywaniu pojedynczych celów za pomoc LAMP, tradycyjne zastosowania multipleksowego (punktu kocowego) PCR, w których tosamo celu jest potwierdzona wielkoci prka na elu, nie s moliwe w przypadku LAMP. Multipleksowanie w LAMP przeprowadzono poprzez wybranie docelowego regionu z miejscem restrykcyjnym i trawienie przed uruchomieniem w elu, tak aby kady produkt dawa odrbn wielko fragmentu, chocia to podejcie zwiksza zoono projektu eksperymentalnego i protokou. Zastosowanie w LAMP polimerazy DNA z wypieraniem nici wyklucza równie zastosowanie sond hydrolizujcych, np. sond TaqMan, które opieraj si na aktywnoci 5'-3' egzonukleazy polimerazy Taq . Opracowano alternatywne podejcie do multipleksacji w czasie rzeczywistym oparte na wygaszaczu fluorescencji.

Mona doda zielony barwnik SYBR, aby wizualizowa LAMP w czasie rzeczywistym. Jednak w pónej amplifikacji amplifikacja starter-dimer moe przyczynia si do faszywie dodatniego sygnau. W przeciwiestwie do tradycyjnych testów PCR z uyciem zielonego barwnika SYBR, analiza krzywej topnienia nie moe by przeprowadzona w LAMP w celu sprawdzenia obecnoci dimerów starterów.

Bibliografia

  1.   Izotermiczna amplifikacja DNA za porednictwem ptli  , Nucleic Acids Res. , tom.  28 N O  12,, E63 ( PMID  10871386 , PMCID  102748 , DOI  10.1093/nar / 28.12.e63 )
  2. [1] https://worldwide.espacenet.com/patent/search/family/018088663/publication/US6410278B1q=pn%3DUS6410278 
  3.   Reakcja przyspieszona przez izotermiczn amplifikacj za porednictwem ptli przy uyciu starterów ptli  , Mol. Komórka. Sondy , obj.  16 N O  3,, s.  223-9 ( PMID  12144774 , DOI  10.1006 / mcpr.2002.0415 )
  4. Wykrywanie reakcji izotermicznej amplifikacji za porednictwem ptli za pomoc zmtnienia pochodzcego z tworzenia pirofosforanu magnezu  ", Biochem. Biofizyka. Res. Pospolity. , tom.  289 n o  1,, s.  150-4 ( PMID  11708792 , DOI  10.1006 / bbrc.2001.5921 )
  5.   Turbidymetria w czasie rzeczywistym reakcji LAMP do ilociowego oznaczania DNA matrycy  , J. Biochem. Biofizyka. Metody , tom.  59 N O  2, s.  14557 ( PMID  15163526 , DOI  10.1016 / j.jbbm.2003.12.005 )
  6.   Metoda amplifikacji izotermicznej za porednictwem ptli (LAMP) do szybkiego wykrywania Trypanosoma brucei rhodesiense  , PLoS Negl Trop Dis , tom.  2 n o  1,, e147 ( PMID  18253475 , PMCID  2238707 , DOI  10.1371 / journal.pntd.0000147 ) Darmowy dostp
  7.   Izotermiczna amplifikacja za porednictwem ptli (LAMP) sekwencji genów i prosta wizualna detekcja produktów  , Nat Protoc , tom.  3, n O  5,, s.  877-82 ( PMID  18451795 , DOI  10.1038 / nprot.2008.57 )
  8. Arunrut, Kampeera, Sirithammajak i Sanguanrut,   Wraliwe wizualne wykrywanie bakterii AHPND przy uyciu amplifikacji izotermicznej za porednictwem ptli w poczeniu z nanoczstkami zota o dziaaniu DNA jako sondami  , PLOS ONE , tom.  11 N O  3,, e0151769 ( PMID  27003504 , PMCID  4803327 , DOI  10.1371 / journal.pone.0151769 )
  9. (w) Mikrobiologia rodowiskowa: obecna technologia i egzekwowanie wód , Norfolk, Wielka Brytania, Caister Academic Press ,, 316  pkt. ( ISBN  978-1-904455-70-7 )
  10. Macarthur G , Globalna diagnostyka zdrowia: badania, rozwój i regulacje. Raport z warsztatów Akademii Nauk Medycznych, Akademia Nauk Medycznych (Wielka Brytania),( ISBN  978-1-903401-20-0 , czytaj online )
  11.   Skuteczno testu amplifikacji izotermicznej za porednictwem ptli (LAMP) do laboratoryjnej identyfikacji izolatów Mycobacterium tuberculosis w warunkach ograniczonych zasobów  , J. Microbiol. Metody , tom.  84, n o  1,, s.  71-3 ( PMID  21047534 , DOI  10.1016 / j.mimet.2010.10.015 )
  12.   Czuy i niedrogi test molekularny na malari falciparum: wykrywanie DNA Plasmodium falciparum bezporednio z krwi poddanej obróbce cieplnej za pomoc amplifikacji izotermicznej za porednictwem ptli  , Clin. Chem. , tom.  52 N O  2, s.  303-6 ( PMID  16339303 , DOI  10.1373 / klinchem.2005.057901 )
  13. Ponaka, Reddy V. et al. | ASTMH 2015 | Wykrywanie molekularne Plasmodium za pomoc izotermicznej amplifikacji za porednictwem ptli (LAMP) i porównanie czuoci z testem PET-PCR | http://www.ilmar.org.il/diasorin/MBI_MalariaPoster2015-ASTMH_JT_rev3.pdf
  14. Ponaka, Reddy V. et al. | AMP 2015 | http://www.ilmar.org.il/diasorin/MBI_AMP2015_MalariaPoster102715.pdf
  15.   Afrykaska trypanosomatoza: czue i szybkie wykrywanie podrodzaju Trypanozoon za pomoc ptli izotermicznej amplifikacji (LAMP) pasoytniczego DNA  , Int. J. Parasitol. , tom.  38 N O  5,, s.  58999 ( PMID  17991469 , DOI  10.1016 / j.ijpara.2007.09.006 )
  16.   Szybkie wykrywanie HIV-1 przez odwrotn transkrypcj, za porednictwem ptli izotermicznej amplifikacji (RT-LAMP)  , J. Virol. Metody , tom.  151 n O  2, s.  26470 ( PMID  18524393 , DOI  10.1016 / j.jviromet.2008.04.011 )
  17.   Izotermiczny test amplifikacji za porednictwem ptli do szybkiej diagnozy infekcji malari w obszarze endemityzmu w Tajlandii  , J. Clin. Mikrobiol. , tom.  52 N O  5,, s.  1471-7 ( PMID  24574279 , PMCID  3993686 , DOI  10.1128 / JCM.03313-13 )
  18.   Odporno izotermicznej reakcji amplifikacji za porednictwem ptli do zastosowa diagnostycznych  , FEMS Immunol. Med. Mikrobiol. , tom.  62, n o  1,, s.  41-8 ( PMID  21276085 , DOI  10.1111 / j.1574-695X.2011.00785.x )
  19.   LAVA: podejcie typu open source do projektowania sygnatur DNA LAMP (za porednictwem ptli izotermicznej)  , BMC Bioinformatics , tom.  12,, s.  240 ( PMID  21679460 , PMCID  3213686 , DOI  10.1186 / 1471-2105-12-240 ) Darmowy dostp
  20. Iseki, Alhassan, Ohta i Thekisoe,   Rozwój metody amplifikacji izotermicznej za porednictwem ptli multipleksowej (mLAMP) do jednoczesnego wykrywania pasoytów Babesia byda  , Journal of Microbiological Methods , tom.  71, n o  3,, s.  281-7 ( PMID  18029039 , DOI  10.1016 / j.mimet.2007.09.019 )
  21. Jednoczesne wykrywanie wielu celów w czasie rzeczywistym za porednictwem ptli izotermicznej amplifikacji  ", BioTechniques , tom.  53 N O  2, s.  81-9 ( PMID  23030060 , DOI  10.2144 / 0000113902 )

Mamy nadzieję, że informacje, które zgromadziliśmy na temat Amplifikacja za porednictwem ptli izotermicznej, były dla Ciebie przydatne. Jeśli tak, nie zapomnij polecić nas swoim przyjaciołom i rodzinie oraz pamiętaj, że zawsze możesz się z nami skontaktować, jeśli będziesz nas potrzebować. Jeśli mimo naszych starań uznasz, że informacje podane na temat _title nie są całkowicie poprawne lub że powinniśmy coś dodać lub poprawić, będziemy wdzięczni za poinformowanie nas o tym. Dostarczanie najlepszych i najbardziej wyczerpujących informacji na temat Amplifikacja za porednictwem ptli izotermicznej i każdego innego tematu jest istotą tej strony internetowej; kierujemy się tym samym duchem, który inspirował twórców Encyclopedia Project, i z tego powodu mamy nadzieję, że to, co znalazłeś o Amplifikacja za porednictwem ptli izotermicznej na tej stronie pomogło Ci poszerzyć swoją wiedzę.

Opiniones de nuestros usuarios

Greg Zych

Wpis _zmienna bardzo mi się przydał.

Mirka Wojciechowski

Bardzo ciekawy ten post o Amplifikacja za porednictwem ptli izotermicznej.

Radek Smoliński

Dzięki. Pomógł mi artykuł o Amplifikacja za porednictwem ptli izotermicznej.