W bakteriofagi lub fagi ( grecki , phageton środki żywności / konsumpcji), rzadziej wirusy bakteryjne , są wirusy infekują tylko bakterie . Są wszechobecne w całej biosferze . Występują wszędzie, zwłaszcza że środowisko jest bogate w bakterie, zwłaszcza w dużych ilościach w odchodach, glebie i ściekach; w jednym mililitrze wody morskiej znajduje się prawie 50 milionów bakteriofagów. Nośnikiem informacji genetycznej ( genomu ) bakteriofagów może być DNA lub RNA . Dzięki kapsydom fagi są klasyfikowane jako złożone wirusy.
Odkrycia aktywności bakteriofagów dokonał w 1897 roku Félix d'Hérelle, kiedy zauważył dziury w tych kulturach bakterii do walki z rojami koników polnych w Ameryce Środkowej, ale którego znaczenie zrozumiał dopiero w 1917 roku, kiedy dokonał tej samej obserwacji w kale pacjentów cierpiących na czerwonkę bakteryjną (choroba okrężnicy ), wyizolowali pierwsze fagi, opracowali pierwsze zastosowania fagoterapeutyczne .
W 1915 roku Frederick W. Twort (w Londynie ) zauważył również, że kolonie mikrokoków czasami przybierają szklisty wygląd w wyniku niszczenia komórek bakteryjnych i że ta cecha jest przenoszona do normalnych kolonii przez zwykły kontakt.
Fagi są podstawowymi narzędziami do badań i badań genetyki molekularnej. Służą one między innymi wektory do klonowania i transferu genów (zwany także przewodzenia). W latach 1940-1960 prace nad bakteriofagami umożliwiły dokonanie wielu postępów w dziedzinie biologii molekularnej (postęp poczyniony przez Maxa Delbrücka w ramach „ grupy fagów ”), aw szczególności umożliwiły odkryć, że kwasy nukleinowe były nośnikiem informacji genetycznej (eksperyment Hershey-Chase w 1952 r.).
Bakteriofagi były używane we Francji do celów terapeutycznych od około 1920 do 1990 roku i nadal są używane w byłym bloku wschodnim , gdzie bakteriofagi można kupić w aptekach bez recepty. We Francji, w obliczu niezdolności władz zdrowotnych do przyspieszenia ponownego wprowadzenia terapii fagowej z powodów regulacyjnych i administracyjnych, stowarzyszenia i grupy pacjentów oraz lekarzy podkreślają istotne korzyści, jakie może ona przynieść pacjentom zakażonym zarazkami. Odporny w sytuacjach terapeutycznych impas lub nawracające przewlekłe zakażenie i brak ryzyka widziany podczas 70 lat eksploatacji we Francji w XX -tego wieku.
Podobnie jak wirusy infekujące eukarionty , fag ma materiał genetyczny zamknięty w złożonej strukturze białkowej, zwykle składającej się z głowy i ogona. W przypadku ponad 95% znanych fagów materiał ten jest dwuniciową cząsteczką DNA o długości od 5 do 650 kbp ( kilozasad ), a ich rozmiar waha się od 24 do 200 nm . Bakteriofagi o genomie większym niż 200 kbp nazywane są „fagami olbrzymimi”.
Fagi charakteryzują się obecnością „blaszek lizy ” . Infekcja komórki bakteryjnej przez pojedynczego faga może spowodować jej lizę po około dwudziestu minutach z uwolnieniem kilkudziesięciu lub nawet setek cząstek faga. W laboratorium każda uwolniona w ten sposób cząsteczka zakaża nową bakterię i rozpoczyna cykl lityczny od nowa. W wyniku tych kaskadowych mikroskopijnych liz w warstwie bakteryjnej na powierzchni płytek agarowych tworzą się „płytki lizy” , co pozwala na odczytanie wyników testu gołym okiem. Rozmiar i wygląd tych płytek lizy stanowią fenotyp przyczyniający się do scharakteryzowania fagów.
Bakteriofagi, niezdolne do samodzielnego rozmnażania się, wstrzykują swój materiał genetyczny do bakterii żywiciela. Dzięki enzymom gospodarza i rybosomom (oraz niektórym białkom wirusowym, w zależności od przypadku), genom wirusa może być replikowany i tłumaczony, tworząc liczne kopie wirusa, które są uwalniane wraz z lizą bakterii żywiciela: mówimy o cyklu litycznym lub cykl produkcyjny.
Niektóre bakteriofagi zachowują się inaczej, ich materiał genetyczny ulega replikacji i integruje się z chromosomem bakterii (lub istnieje jako plazmid ), ale nie ulega ekspresji w celu utworzenia wirionów. Wirus jest wtedy określany jako profag , który jest przenoszony na potomstwo zakażonej bakterii (linia lizogeniczna) i mówimy o lizogenezie lub cyklu lizogennym . W odpowiedzi na indukcję (np. Stres wywołany przez bakterie) infekcja lizogeniczna przechodzi w cykl lityczny.
Od jednego gatunku do drugiego cykl replikacji faga w komórce może przebiegać według kilku wzorców:
Fagi, podobnie jak inne wirusy, są wrażliwe na słoneczne promienie UV , o których wiadomo, że pomagają niszczyć wirusy, przynajmniej na szczycie słupa wody i mniej lub bardziej głęboko, w zależności od zmętnienia wody.
W wodach bardziej eutroficznych, a nawet dystroficznych , inną przyczyną destrukcji wirusów (wciąż słabo poznanych) wydaje się być obecność rozpuszczonych, nietrwałych termicznie i o dużej masie cząsteczkowej (ponad 30 kDa ) cząsteczek przeciwwirusowych , takich jak proteazy lub inne enzymy bakteryjne , prawdopodobnie które podczas eksperymentów Noble i in. w 1997 roku wydawał się być odpowiedzialny za około 1/5 maksymalnego rozpadu wirusów; oprócz promieniowania słonecznego, które eliminuje maksymalnie 1/3 do 2/3 (w przypadku obcych wirusów) i 1/4 do 1/3 w przypadku natywnych wirusów), co sugeruje zjawisko koewolucji ewolucyjnej adaptacji między bakteriami a wirusami oraz w zależności od szybkości przenikania promieniowania UV do słupa wody.
Organem odpowiedzialnym za nazewnictwo i taksonomię wirusów jest Międzynarodowy Komitet Taksonomii Wirusów (ICTV). Istnieje około dwudziestu różnych morfologii wirusów bakteryjnych rozpoznawanych obecnie przez ICTV. W 2000 roku zaobserwowano i opisano ponad 5000 różnych bakteriofagów. Ponad 95% z nich miało ogon zaangażowany we wnikanie DNA faga do komórki bakteryjnej (rodzina Caudovirales ). Morfologia ogona pozwala na podzielenie tej dużej rodziny na 3 grupy :
Ponieważ fagi mogą przenosić w swoim genomie geny, które są akcesoriami do ich cyklu życiowego, uczestniczą w poziomych transferach genów między populacjami bakterii. To jest transdukcja . Kiedy te dodatkowe geny kodują czynniki wirulencji, zakażona bakteria widzi wzrost swojej patogenności - jest to zjawisko „konwersji lizogennej”.
Dobrze znanym przykładem są geny toksyny Stx enterokrwotocznej Escherichia coli ( EHEC ). Te geny stx są zlokalizowane w sekwencjach bakteriofagów lambdoidów zintegrowanych z chromosomem. Dlatego EHEC powstałyby w wyniku konwersji lizogennej. Znanych jest wiele innych przykładów tego typu, takich jak toksyna cholery z Vibrio cholerae, która jest przenoszona przez faga CTX.
Lizogenne bakteriofagi są często włączane do chromosomu w locus kodującym transferowe RNA (tRNA). Na przykład fag ¨PhiR73 z Escherichia coli jest wstawiony w locus selC . Pozyskanie obcych genów poprzez transfer poziomy, dzięki bakteriofagom integrującym się w takich „gorących punktach” jest prawdopodobne, ponieważ sekwencje kodujące tRNA są wysoce konserwatywne między różnymi gatunkami bakterii. Wreszcie, trwałość genów wirulencji w genomach fagów sugeruje, że zapewniają one selektywną przewagę, prawdopodobnie ze względu na większe namnażanie i dyfuzję bakterii gospodarza.
W latach sześćdziesiątych XX wieku badania przeprowadzone przez amerykańskich biologów Maxa Delbrücka , Alfreda Hersheya i Salvadora Lurię nad interakcjami gospodarz / fag przyniosły tym badaczom w 1969 roku Nagrodę Nobla w dziedzinie fizjologii medycyny .
Fagi pozwoliły na różne odkrycia:
Badanie fagów ma ważne implikacje dla medycyny i genetyki , zwłaszcza dla zrozumienia infekcji wirusowych, nieprawidłowości genetycznych, embriologii człowieka, przyczyn raka i oporności bakterii na antybiotyki.
Fagi są wykorzystywane na wiele sposobów w biologii molekularnej. Są używane jako wektory do klonowania do wstawiania DNA do bakterii. Metoda prezentacji na fagach to metoda, która pozwala na dobór peptydu dzięki jego prezentacji na powierzchni faga. Prezentacji na fagach jest techniką do konstruowania biblioteki komplementarnego DNA lub DNA. Dwa główne fagi stosowane w tej technice to M13 (fag nitkowaty) i fagi lambda, które infekują E. Coli . Weźmy przykład faga M13, który jest fagiem nitkowatym zdolnym do infekowania tylko bakterii gram (-), które włączyły czynnik F i których infekcja prowadzi do lizogenezy. Jego kapsyd zawiera między innymi białka P8 i P3 niezbędne do wiązania bakteriofaga z bakterią za pośrednictwem pilusów płciowych. Te 2 białka zostaną użyte do zaprezentowania interesujących cząsteczek (peptydu, fragmentu przeciwciała lub całego białka) na powierzchni faga: interesująca cząsteczka jest połączona z białkami P8 i P3, poprzez wstawienie genu kodującego cząsteczkę będącą przedmiotem zainteresowania w pobliżu 5 'koniec genów P3 i P8 z zachowaniem ramki odczytu. Jedno lub drugie białko jest używane w zależności od typu cząsteczki i ilości cząsteczek, które mają być eksponowane na powierzchni faga. Rozróżnia się fagi wielowartościowe / homogeniczne, w których wszystkie białka P3 i P8 są połączone, od fagów jednowartościowych / heterogenicznych, w których tylko część białek jest połączona. Technika umożliwia uzyskanie bibliotek DNA, które można łatwo konserwować, a wybrane klony są namnażane niewielkim kosztem. Technika ta umożliwi produkcję przeciwciał bez konieczności immunizacji zwierzęcia. Ograniczenie techniki: niektórych cząsteczek nie można wyrazić jako cząsteczek toksycznych dla komórki gospodarza. W związku z tym zdolność transformacji E. Coli jest ograniczona .
Sekwencjonowanie genomu nie nastąpi od razu, ale po trochu na fragmentach genomów. W tym celu te fragmenty DNA mogą być przechowywane i namnażane w organizmach służących jako banki DNA. Umożliwiają to fagi jako wektory do klonowania.
Fagi, stosowane głównie w przemyśle spożywczym, a następnie w weterynarii, są również badane w medycynie jako alternatywa dla oporności na antybiotyki. W Holandii sprzedawany jest również koktajl fagowy do zwalczania zakażeń Listeria w produktach spożywczych.
Środek konserwujący do żywnościW 2006 roku , w Stanach Zjednoczonych , o przygotowanie bakteriofaga oparciu o sześć wirusów bakteriofagów został dopuszczony jako konserwant żywności , w szczególności w celu zwalczania listeriozy .
Medycyna weterynaryjnaPonad połowa produkowanych antybiotyków jest wykorzystywana w hodowli zwierząt. Preparaty na bazie fagów stanowią interesującą alternatywę w zwalczaniu i zapobieganiu infekcjom. W Norwegii przeprowadza się badania kliniczne w akwakulturze.
Medycyna ludzkaFagi lityczne mogą być używane do zwalczania infekcji bakteryjnych, te terapie fagowe zostały wyobrażone i zastosowane, gdy tylko te wirusy zostały odkryte. Nazywa się to leczeniem bakteriofagami . Stosowano je najpierw we Francji, w Niemczech, potem w niepodległej Gruzji , w ZSRR, w Polsce , w Stanach Zjednoczonych i wreszcie na całym świecie, z dodatkiem antybiotykoterapii lub bez .
We Francji ich stosowanie i marketing zniknęły na początku lat 80. (znaleziono je w Vidal do 1978 r. I nadal były używane przez lata w niektórych szpitalach, takich jak Montpellier), ich skuteczność nie jest kwestionowana. Ale ich stosowanie jest mniej praktyczne. niż antybiotyki i pozostając dość empirycznym (brak oceny specyficzności fagów, brak miareczkowania roztworów itp.). W ten sam sposób Eli Lilly zaprzestaje sprzedaży fagii w Stanach Zjednoczonych wraz z rozwojem antybiotyków.
Z drugiej strony stosowanie leków bakteriofagowych utrzymuje się w krajach bloku sowieckiego i nadal są one powszechnie stosowane w Gruzji i Rosji. Leki bakteriofagiczne są systematycznie stosowane w Rosji jako pierwsze podejście do leczenia niektórych infekcji, takich jak shigelloza . Zużycie w Rosji wynosi ponad 1 000 000 000 (jeden miliard) pudełek fagów rocznie.
Terapia fagowa jest obecnie przedmiotem ponownego zainteresowania, ponieważ stanowi rozwiązanie w leczeniu zakażeń szczepami bakterii opornymi na antybiotyki. Bakteriofagi stanowią poważną drogę do odkrycia trwałych metod leczenia infekcji bakteryjnych.
Kilka firm na całym świecie pracuje nad rozwojem rozwiązań bakteriofagowych zgodnie z zachodnimi standardami. We Francji firma Pherecydes Pharma opracowuje „koktajle fagowe” do leczenia / zapobiegania infekcjom dużych, odsłoniętych ran (w szczególności oparzeniom) i infekcjom płuc.
Terapia fag jest obecnie możliwe we Francji w ramach tymczasowego zezwolenia na użycie zarejestrowany, to znaczy w każdym przypadku iw granicach przewidzianych przez ANSM:
Dodaje się następujące ograniczenia:
W obliczu trudności związanych z leczeniem się bakteriofagami w ramach prawnych we Francji utworzono organizacje pacjentów, aby ułatwić dostęp do terapii fagowej zarówno we Francji, jak i za granicą.
Kilka francuskich stowarzyszeń skupia się na bakteriofagach:
Phages.fr : francuska sieć naukowa o zasięgu krajowym, której celem jest promowanie, koordynacja i integracja badań interakcji bakteriofagi-bakterie w różnych dyscyplinach naukowych, przy jednoczesnym promowaniu nawiązywania współpracy i synergii między laboratoriami.
AVIBEP : Stowarzyszenie Ofiar Zakazu Obcych Bakteriofagów i ich Krewnych ma na celu pomóc pacjentom uzyskać dostęp do francuskich i zagranicznych fagów, tak aby pacjent nie był już skazany na śmierć lub amputację bez wcześniejszego leczenia fagoterapią jeśli to możliwe, w tym z obcym bakteriofagiem, jeśli to konieczne. Stowarzyszenie domaga się, aby z jednej strony leki dopuszczone za granicą były automatycznie dopuszczane do obrotu we Francji w ramach istniejących współczujących przepisów, az drugiej strony, aby ponownie utworzyć we Francji ośrodek produkcji bakteriofagów. w Paryżu, Lyonie i Strasburgu od pięćdziesięciu lat robią to dla lekarzy i szpitali miejskich. Opiera się na badaniu Burden BMR, które stwierdza, że każdego roku ginie około 10 000 osób, które mogłyby zostać uratowane przez obce bakteriofagi.
Le Lien : Stowarzyszenie na rzecz ochrony pacjentów i użytkowników zdrowia. Jego podstawową misją jest obrona ofiar zakażeń szpitalnych i wypadków medycznych, niezależnie od tego, czy są to błędy, pomyłki czy zagrożenia. Prowadzi kampanię na rzecz ponownego wprowadzenia bakteriofaga we Francji.
Phag Espoirs : ma na celu z jednej strony promowanie badań i wykorzystania bakteriofagów w diagnostyce i terapii, az drugiej strony wspieranie pacjentów pragnących dowiedzieć się więcej o bakteriofagach. Stowarzyszenie tworzą głównie lekarze.
Phages sans frontières : zbieranie funduszy i porady dotyczące pomocy pacjentom w poszukiwaniu leczenia w Gruzji.
PHELIX France: we współpracy z Uniwersytetem w Leicester w Wielkiej Brytanii realizuje projekt wykrywania przewlekłych zakażeń Borrelia (borelioza) przy użyciu wirusów bakteriofagowych.