Pierwszy opisano w 2009 r aktywatora transkrypcji jak efektorowych nukleazy s (Talensa, aktywatora transkrypcji jak nukleazy efektorowych ) są sztuczne enzymy restrykcyjne wytwarzane przez fuzję domeny wiążącej DNA , zwanych Tale z domeną mającego zdolność rozszczepiania DNA .
Te enzymy restrykcyjne są enzymami, które mają zdolność do cięcia DNA o określonej sekwencji. Aktywatora transkrypcji jak efektorów (Tales aktywatora transkrypcji jak efektorów) można szybko aby wiązać się praktycznie dowolnej kolejności DNA. Łącząc domenę TALE z domeną cięcia DNA (która przecina nić DNA), można w ten sposób stworzyć specyficzne enzymy restrykcyjne dla dowolnej sekwencji DNA. Gdy te enzymy zostaną wprowadzone do komórek, można je następnie wykorzystać do modyfikacji genomu in situ .
Efektorowych TAL (BAJKA) są białkami wydzielanymi przez bakterie Xanthomonas . Domena wiążąca DNA składa się z powtórzeń 33 lub 34 identycznych aminokwasów z wyjątkiem aminokwasów 12 i 13. Te dwie reszty są bardzo zmienne i wykazują silną korelację z rozpoznawaniem specyficznego nukleotydu . Ta prosta zależność między sekwencją aminokwasów a rozpoznawaniem DNA umożliwia tworzenie specyficznych dla sekwencji domen wiążących DNA poprzez wybranie zestawu powtarzających się segmentów zawierających odpowiednie reszty zmienne.
Nieswoistą domenę cięcia DNA endonukleazy Fok1 można zastosować do skonstruowania nukleaz hybrydowych, które okazały się skuteczne w testach na drożdżach. Białka te są również aktywne w komórkach roślin i zwierząt. Pierwsze badania nad TALEN przeprowadzono z pierwotną domeną Fok1, ale nowsze podejścia wykorzystują domeny zawierające mutacje specjalnie zaprojektowane w celu zwiększenia specyficzności i wydajności cięcia DNA. Domeny Fok1 działają jako dimer , co wymaga dwóch konstruktów z domenami wiążącymi DNA skierowanymi przeciwko miejscom w genomie o orientacji od głowy do ogona i prawidłowych odstępach. Liczba aminokwasów między domeną TALE i domeną Fok1, jak również liczba zasad między dwoma miejscami wiązania w genomie to dwa ważne parametry zapewniające dobrą aktywność chimerycznego enzymu.
Prosta zależność między sekwencją aminokwasów a sekwencją DNA rozpoznawaną przez domenę wiążącą DNA umożliwia syntezę spersonalizowanych białek. W przypadku TALEN sztuczna synteza genu kodującego enzym jest problematyczna, ponieważ powtarzające się sekwencje domeny wiążącej DNA grożą hybrydyzacją ze sobą na etapach syntezy oligonukleotydów . Jednym z rozwiązań pozwalających przezwyciężyć ten problem jest użycie ogólnodostępnego oprogramowania ( DNAWorks ) w celu określenia odpowiednich oligonukleotydów do składania w dwóch etapach PCR, po których następuje amplifikacja całego genu. Opracowano również kilka innych procedur składania domen TALE.
Po złożeniu genów kodujących TALEN są one wstawiane do plazmidów . Plazmidy są następnie używane do transfekcji pożądanych komórek, w których białko TALEN zostanie następnie wyrażone i przejdzie do jądra, aby uzyskać dostęp do genomu. TALEN mogą być również dostarczane do komórki w postaci mRNA, co eliminuje możliwość integracji genomowej genu kodującego TALEN.
TALEN można wykorzystać do modyfikacji genomu poprzez ich zdolność do wywoływania pęknięć podwójnej nici DNA (DSB), na które komórki reagują poprzez mechanizmy naprawy DNA . Niehomologicznej końcowego Przyłączanie (NHEJ) naprawy daje dwa końce DNA pochodzące z dwuniciowym przerwy być połączone, gdy sekwencja komplementarna nie jest dostępna, aby służyć jako model do naprawy.. Ten mechanizm naprawy wywołuje błędy w genomie poprzez insercje i / lub delecje; a także przegrupowania chromosomów. Wszystkie te błędy mogą spowodować, że produkt genu zakodowany w tym locus będzie niefunkcjonalny. Ponieważ aktywność enzymu może się różnić w zależności od gatunku, typu komórki, zastosowanego genu docelowego i nukleazy, przy projektowaniu TALEN należy wziąć pod uwagę te parametry i rozważyć generowanie mutacji. Prosty eksperyment z rozszczepianiem heterodupleksu może wykryć różnice między dwoma allelami amplifikowanymi przez PCR. Produkty rozszczepienia można uwidocznić na żelu agarozowym . Alternatywnie, DNA można wprowadzić do genomu, korzystając z dbałości NHEJ o zapewnienie egzogennego źródła DNA .
Homologiczna rekombinacja może również pozwolić na wprowadzenie obcego DNA w miejscu pęknięcia, a transfekowany dwuniciowy DNA może być użyty przez enzymy naprawcze jako matryca.
TALEN były wykorzystywane do generowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i genetycznie modyfikowanych komórek iPS , ale także do generowania nokautów w różnych organizmach, takich jak C. elegans , szczury, myszy, a nawet danio pręgowany . Wykazano również, że użycie dwóch par TALEN pozwala na jednoczesną modyfikację dwóch genów w tym samym czasie. Od niedawna technika ta może być również używana do generowania uderzeń . W ten sposób TALEN wstrzyknięto do oocytów szczurów, co umożliwiło wywołanie u szczurów knock-in dla receptora glukokortykoidowego.
Jeśli TALEN nie jest wystarczająco specyficzny dla swojego miejsca docelowego lub nie jest ukierunkowany na unikalną sekwencję w genomie będącym przedmiotem zainteresowania, mogą wystąpić niepożądane cięcia. Ten rodzaj artefaktu może spowodować wystarczającą liczbę dwuniciowych pęknięć , aby przytłoczyć maszynerię naprawy DNA , powodując przegrupowania chromosomów, a nawet śmierć komórki . Te niespecyficzne rozszczepienia mogą również mieć miejsce w przypadku innych sztucznych nukleaz, takich jak nukleazy palca cynkowego , których niespecyficzne działanie jest lepiej scharakteryzowane.