Enzymatyczny test immunologiczny ELISA ( angielski enzymatyczny test immunosorbentu , dosłownie „technika enzymatycznego immunosorbentu”, to znaczy technika enzymatycznego testu immunologicznego na stałym podłożu) jest badaniem laboratoryjnym. Ta metoda jest używana głównie do wykrywania obecności przeciwciała lub antygenu w próbce .
Ta technika analizy biochemicznej mieści się w bardziej ogólnych ramach immunoenzymatycznych technik wykrywania (lub EIA w przypadku testów immunoenzymatycznych ), w których śledzone jest rozpoznawanie antygenu badanego przez określone przeciwciało (lub odwrotnie przeciwciała badanego przez antygen) poprzez reakcję katalizowaną przez enzym, który uwalnia barwny składnik, którego ilość jest oznaczana metodą spektroskopii . Aby to zrobić, antygen jest rozpoznawany przez przeciwciało kowalencyjnie połączone z enzymem (lub odwrotnie, przeciwciało jest rozpoznawane przez znakowany antygen). Wiązanie wyznakowanej cząsteczki spowoduje, po zastosowaniu chromogennego lub fluorogennego substratu enzymu związanego z przeciwciałem, emisję sygnału kolorowego lub fluorescencyjnego. Technikom tym należy przeciwstawić się testom radioimmunologicznym (lub RIA w przypadku testów radioimmunologicznych ), w których znakowanie jest wykonywane przez pierwiastek radioaktywny, którego aktywność radiologiczną mierzy się liczbą rozpadów na sekundę. Aby ułatwić wdrożenie tej techniki, w szczególności w przypadku dużej liczby analizowanych próbek, przeciwciało specyficzne dla żądanego antygenu lub antygen rozpoznawany przez żądane przeciwciało jest połączone z zastosowanym nośnikiem, który jest nim pokryty, stąd nazwa techniki immunoabsorpcji. Istnieje kilka odmian protokołów operacyjnych, które umożliwiają zwiększenie swoistości lub czułości rozpoznawania antygenu (pośredni, kanapkowy lub konkurencyjny ELISA).
Ponieważ ELISA może być stosowana do oceny zarówno obecności antygenu, jak i przeciwciała w próbce, jest skutecznym narzędziem zarówno do określania stężeń przeciwciał w surowicy (jak w przypadku testu na HIV lub testu na HIV. Wirus Nilu ), tylko do wykryć obecność antygenu. Znalazł również zastosowanie w przemyśle spożywczym do wykrywania alergenów pokarmowych , takich jak mleko , orzeszki ziemne , orzechy z drzew orzechowych i jaja . Jest to prosty, łatwy w użyciu i niedrogi test. Jest ograniczona dostępnością specyficznych przeciwciał.
Aby poprawić czułość wykrywania antygenu, przeciwciało, które rozpoznaje żądany antygen, może nie być sprzężone z enzymem, ale może być rozpoznawane specyficznie przez drugie przeciwciało, które samo zostanie połączone z enzymem .
Enzym działa jako wzmacniacz: nawet jeśli przyłączonych jest niewiele przeciwciał skoniugowanych z enzymem, enzym katalizuje tworzenie wielu sygnałów, co czyni ten test bardzo czułym, ale także zwiększa liczbę fałszywie pozytywnych wyników . Dlatego logicznie konieczne jest zapewnienie dołków kontrolnych.
Etapy tzw. Pośredniej ELISA, najczęściej stosowanej do określenia stężenia przeciwciał w surowicy, to:
Test kanapkowy ELISA jest mniej powszechnym (klinicznym) wariantem tej techniki, używanym do wykrywania próbki antygenu w surowicy lub dowolnej innej próbce. Z drugiej strony ta technika jest bardzo powszechna w badaniach.
Proces przebiega w szerokim zarysie w następujący sposób:
Jednakże, jak zilustrowano, zwykle występuje dodatkowy etap, dodanie przeciwciał wykrywających , w celu uniknięcia tworzenia przeciwciał skoniugowanych z enzymem dla każdego antygenu . Zastosowanie sprzężonego enzymu, który rozpoznaje resztę Fc innych przeciwciał, pozwala na użycie go w różnych sytuacjach i zmniejsza koszt zabiegu.
Ten wariant pozwala na oznaczenie antygenu z wykorzystaniem zasady współzawodnictwa wiążącego:
Istnieje zatem konkurencja między znakowanymi antygenami (w znanej ilości) i nieznakowanymi (w ilości do ustalenia) o ich wiązanie z przeciwciałami, których brakuje. Zatem im więcej antygenów ma być oznaczonych, tym większy jest ich udział wśród antygenów zatrzymywanych przez przeciwciała i tym słabszy będzie sygnał. I odwrotnie, jeśli początkowe stężenie antygenu jest niskie, sygnał będzie silny.
ELISA można przeprowadzić w celach ilościowych lub jakościowych:
Bezpośredni test ELISA jest używany do oznaczania różnych białek. Kilka przykładów zaczerpniętych z zastosowań w farmakologii medycznej: hormony tarczycy, stężenie leku (w celu oceny zgodności i / lub dostosowania dawki ) itp.
Najbardziej znaną aplikacją dla ogółu społeczeństwa jest pierwsza linia testów na obecność wirusa HIV .
Technika ELISA umożliwia detekcję przeciwciał HIV przeciwciał w krwi osocza (stąd określenie „seropozytywnych” lub „seronegatywnego). Technika ta jest bardzo wrażliwa (w większości przypadków są wykrywane i” fałszywe negatywne "(= testy ujemna, gdy pacjent seropozytywne) są prawie wykluczone, przynajmniej jeśli test jest przeprowadzany w ciągu trzech miesięcy po kontakcie z infekcją) i akceptowalną specyficzność (niski odsetek „ fałszywie dodatnich ” (= dodatni wynik testu na reakcję przeciwciała z niespecyficznym antygenem Jednak w przypadku pozytywnej serologii anty-HIV próbki powinny zostać poddane testom potwierdzającym, takim jak western blot , który wykorzystuje technikę opartą na elektroforezie i którego wskaźnik błędów jest wyjątkowo niski.