W hydrogenases są enzymami , które katalizują odwracalne przekształcanie jonów H + ( „protony”) w diwodorofosforan , zgodnie z reakcją:
2H + + 2e - = H 2
Miejsca aktywne tych enzymów mają naturę metaloorganiczną i różnią się między sobą w szczególności naturą metali, z których się składają. Istnieją zatem trzy klasy hydrogenaz: hydrogenazy [NiFe], hydrogenazy z samym żelazem [FeFe] i hydrogenazy wcześniej zwane bezmetalowymi, ale które w rzeczywistości zawierają żelazo.
W 1887 roku Hoppe-Seyler odkrył, że bakterie mogą rozkładać mrówczan na H 2 i CO 2 . Nazwę „hydrogenaza” nadali Stevenson i Stickland w 1931 r. Po zaobserwowaniu produkcji wodoru przez bakterie w okrężnicy i jego wykorzystaniu do redukcji substratów . Hydrogenazy odnoszą się teraz do klasy enzymów, które mogą odwracalnie katalizować konwersję protonów do wodoru:
Katalizują one tę reakcję przy potencjale bardzo blisko potencjał termodynamiczny (E ° app = -413 mV w wodzie, w temperaturze 25 ° C pod 0,1 barów H 2 i pH 7). W tych organizmach wodór może pełnić dwie funkcje.
Pierwszą funkcją jest energia: nadmiar mocy redukującej można wyeliminować w postaci wodoru.
Druga funkcja wykorzystuje metaboliczny wodoru jako substrat redukującego redukcja CO 2 do metanu w Methanobacterium , do kwasu octowe w Acetobacterium , uwodornienie z fumaranu w succinogenes Vibrio , wytwarzanie NAD (P) H w diaforazy hydrogenases jak w Ralstonia eutropha ...
Jeśli hydrogenazy są znane od ponad wieku, to określenie ich struktury, a zwłaszcza miejsc aktywnych, było wynikiem długiego procesu:
W 1956 roku potwierdzono obecność żelaza niehemowego . W latach siedemdziesiątych XX wieku eksperymenty RPE wykazały, że hydrogenazy zawierały klastry żelazo-siarkowe typu ferredoksyna HiPIP („białko żelazowo-siarkowe o wysokim potencjale”). W 1980 roku Thauer wykrył obecność niklu w niektórych hydrogenazach, co dało początek wielu spekulacjom na temat natury miejsca aktywnego. Obecnie ustalono, że istnieją dwie główne klasy hydrogenaz, hydrogenaz [NiFe] i żelazowodór, a także pokrewna klasa zwana hydrogenazą bez klastra żelazowo-siarkowego lub Hmd. Znamy około stu hydrogenaz rozmieszczonych w około czterdziestu organizmach.
Dwie główne klasy hydrogenaz wyróżnia ich aktywność oraz bardzo oryginalne miejsca aktywne. Rzeczywiście, obecność miejsc metaloorganicznych posiadających ligandy cyjankowe i karbonylowe jest wyjątkowym faktem w biologii. Jest to tym bardziej niezwykłe, że te cząsteczki protetyczne są ogólnie uważane za toksyczne dla organizmów żywych.
Występują tylko w eubakteriach i eukariotach . Struktury 3D funkcjonalnych wodoraz Fe zostały rozwiązane prawie jednocześnie w dwóch bakteriach beztlenowych: D. desulfuricans i C. pasteurianum . Struktury tych enzymów są zupełnie inne, ale oba mają skupiska [Fe-S] zdolne do odprowadzania elektronów między powierzchnią a miejscem aktywnym głęboko w białku. Miejsce aktywne zwane klastrem-H składa się z klastra [4Fe-4S] połączonego mostkującą cysteiną z żelaznym klastrem dwujądrowym (patrz ryc. 2). Atomy żelaza tego dwupierścieniowego klastra mają ligandy cyjankowe i karbonylowe i są połączone mostkowym ligandem protetycznym typu [1,3-propanoditiolanu]. Analiza wiązań wodorowych między tym ligandem a wnęką oraz intuicja krystalografa mogą sugerować, że atomem centralnym byłby atom azotu ( ligandem mostkującym byłaby wówczas ditiometyloamina ). Natura centralnego atomu jest nadal kontrowersyjna; Niedawne wyniki sugerują, że może to być tlen (ligandem mostkującym byłby eter ditiometylowy).
H funkcjonalna 2 produkującego hydrogenases Fe obecnie jedynie u organizmów z metabolizm beztlenowy. Z drugiej strony systematyczne przeszukiwania baz danych ujawniły obecność genów kodujących białka homologiczne u eukariontów z metabolizmem tlenowym (grzyby, rośliny i zwierzęta). Funkcja tych białek w komórkach eukariotycznych tlenowych nie jest jeszcze w pełni zrozumiały, ale hydrogenaza podobne działania może zostać wykluczone, ponieważ nie H 2 produkcja zaobserwowano w komórkach eukariotycznych tlenowych. Są to białka, które wiążą klastry Fe / S, przynajmniej w drożdżach i roślinach. Uważa się, że w Saccharomyces cerevisiae białko ScNar1p bierze udział w dojrzewaniu cytozolowych i jądrowych białek klastra Fe / S. U ludzi istnieją dwa geny kodujące hydrogenazy, takie jak. Pierwszy gen koduje białko zwane IOP1, zaangażowane w regulację degradacji HIF1 i dojrzewania klastrów białek Fs / S u ludzi. Drugi gen koduje białko zwane IOP2, dawniej NARF, które rozpoznaje farnezylowany i niedojrzały koniec prelaminy A. W roślinach obecny jest tylko jeden gen, a inaktywacja tego genu u Arabidopsis thaliana pokazuje, że gen ten bierze udział w rozwoju. Zmutowane pokazuje linia karłem fenotyp, który jest odwrócony, kiedy linia rośnie w 5% O 2 . Ten związek z O 2 wykazano również u Caenorhabditis elegans i drożdżaków, u których wzrost w umiarkowanie niedotlenionym podłożu odwraca obserwowane zmutowane fenotypy.
Najliczniejszą z hydrogenaz są hydrogenazy [NiFe]. Występują w wielu mikroorganizmach, takich jak bakterie acetogenne , wiążące azot, cyjanobakterie redukujące siarczany ( sinice ), ale także u archeonów. Z drugiej strony jest niewiele hydrogenaz [NiFeSe]. Te dwa typy hydrogenaz można podzielić na cztery duże grupy według ich funkcji komórkowych. Porównanie dopasowania sekwencji, a dokładniej dwóch konserwowanych regionów (wokół cystein w miejscu aktywnym oraz w pobliżu stref N- i C-końcowych) umożliwia znalezienie tych czterech klas. Grupa 1 składa się z hydrogenaz [NiFe] związanych z membranami, które wykorzystują wodór jako źródło energii. Druga grupa składa się z heterodimerycznych cytoplazmatycznych hydrogenaz i nie występuje u archeonów. Trzecia grupa składa się z heteromultimerycznych cytoplazmatycznych hydrogenaz, które mogą wiązać kofaktor ( F420 , NAD lub NADP ) i działać odwracalnie. Czwartą i ostatnią grupę stanowią hydrogenazy związane z membranami wytwarzającymi wodór. Są od 50 do 100 razy mniej aktywne niż hydrogenazy żelaza w produkcji i utlenianiu wodoru (do 1000 cykli katalitycznych na sekundę).
Hydrogenazy [NiFe] charakteryzują się heterobimetalicznym centrum aktywnym zawierającym atom żelaza i atom niklu. Struktury krystalograficzne tych enzymów są znane dla pięciu organizmów i są dwojakiego rodzaju: hydrogenaz [NiFeSe] i hydrogenaz [NiFe] z ligandami karbonylowymi. Hydrogenazy [NiFeSe] są obecne w bakteriach redukujących siarczany i mogą być okołoplazmatyczne lub cytoplazmatyczne.
Hydrogenazy [NiFe]Są to pierwsze hydrogenazy, których struktury krystalograficzne były znane. Są też najbardziej przebadani. Hydrogenaza Desulvibrio (D.) gigas [NiFe] , jest heterodimerycznym białkiem peryplazmatycznym , składającym się z dwóch podjednostek o masie 60 i 28 kDa. Ma trzy klastry [Fe-S]: jeden klaster [3Fe-4S] 1 + / 0 i dwa klastry [4Fe-4S] 2 + / 1 + . Są rozmieszczone prawie liniowo w małej podjednostce na długości 12 Å . Klaster znajdujący się najbliżej miejsca aktywnego znajduje się 13 A od miejsca aktywnego i jest nazywany klastrem proksymalnym lub klastrem-p. Klaster najbardziej oddalony od miejsca aktywnego ( klaster dystalny lub klaster-d) znajduje się prawie na powierzchni białka. Gromady te tworzą zatem „ścieżkę” dla elektronów, między donorem ekstraproteiny a miejscem aktywnym. Hydrogenazy [NiFe] miałyby atom magnezu w domenie C-końcowej. Z drugiej strony kanał hydrofobowy umożliwia cyrkulację wodoru z zewnątrz do miejsca aktywnego, a dokładniej w pobliżu wolnego miejsca końcowego niklu. Centrum aktywne zawiera atom niklu koordynowany przez cztery cysteiniany tworzące silnie zniekształcony czworościan (patrz Rys. 4 i Rys. 6). Dwie z tych cysteinianów koordynują również atom żelaza. Ten atom żelaza ma również dwa ligandy cyjankowe i ligand karbonylowy. Ligandy cyjankowe oddziałują z wodorem z bocznymi łańcuchami reszt we wnęce. Miejsce koordynacyjne na żelazie jest zatem puste i aby uzupełnić żelazną sferę koordynacyjną , może być obecny inny ligand. Niedawne wyniki krystalograficzne sugerują obecność utlenionego ligandu wodorotlenkowego lub wodoronadtlenku , łączącego nikiel i żelazo podczas utleniania białka. Inne wyniki krystalograficzne i elektrochemiczne sugerują, że ten ligand może być również siarczkiem.
Hydrogenazy [NiFeSe]Hydrogenazy [NiFeSe] tworzą podklasę hydrogenaz [NiFe]. Zawierają jeden atom selenu na białko. D. baculatum peryplazmatyczna hydrogenaza została wykrystalizowana. Jest to heterodimer zawierający dwie podjednostki 26 i 49 kDa. Trzy skupiska [4Fe-4S] są zlokalizowane w małej podjednostce, podczas gdy duża podjednostka zawiera „tylko” miejsce aktywne. Jest bardzo podobny do hydrogenazy [NiFe]. Główną oryginalnością tego enzymu jest zastąpienie końcowej cysteiny ligandem selenocysteiny w miejscu aktywnym. W sélénocystéinates mogli łatwiej sprotonowania cystéinates. To wyjaśniałoby różnice w reaktywności. W miejscu aktywnym krystalicznej hydrogenazy odległość między niklem a żelazem wynosi 2,5 Å . Hydrogenazy [NiFe] miałyby atom magnezu w domenie C-końcowej. W przypadku hydrogenaz [NiFeSe] atom ten zostałby zastąpiony atomem żelaza.
Ściśle rzecz biorąc, nie są one hydrogenazami, ponieważ nie wykorzystują protonów do produkcji wodoru. Jednak wiele podobieństw z hydrogenazami nadaje mu tę nazwę. Długo zwane hydrogenazami wolnymi od metali, zostały przemianowane na 2000 hydrogenaz bez klastra [Fe-S] po odkryciu motywu żelaza w kofaktorze tego enzymu. To żelazo jest niehemowe i ma dwa ligandy karbonylowe. Kofaktor jest dezaktywowany w świetle poprzez utratę związanej z nim jednostki karbonylku żelaza.
Są one również znane pod nazwą Hmd dla dehydrogenazy metylentetrahydrometanopteryny tworzącej H- 2 . Mają go tylko niektóre metanogenne archeony. Te hydrogenazy różnią się znacznie od pozostałych dwóch, ponieważ nie zawierają klastrów [Fe-S] i nie mają takiej samej reaktywności. W rzeczywistości katalizują one odwracalnie reakcję redukcji N 5 , N 10- metenylotetrahydrometanopteryny do N 5 , N 10- metenylenotetrahydrometanopteryny w obecności wodoru. Odpowiada to przeniesieniu wodoru do podłoża i uwolnieniu protonu w roztworze. Hydrogenases te nie są zdolne do katalizowania redukcji methylviologene przez H 2 , ani do katalizowania wymiany protonów H 2 z deuteru ciężkiej wody. Dlatego ściśle mówiąc nie są one hydrogenazami. Jednak ich zdolność do wykorzystywania wodoru przyniosła im nazwę „hydrogenaza”.
Aktywność tych enzymów silnie zależy od pH. Zasadowe pH sprzyja tworzeniu metenylo-H 4 MPT +, podczas gdy kwaśne pH i obecność wodoru sprzyjają tworzeniu metylenowo-H 4 MPT. Na przykład, reakcję odwodorniania mogą być wykonane z maksymalną prędkością 2700 moli / min / mg białka dla Methanopyrus kandleri do wartości poniżej 4,5 do więcej niż 90 ° C .