Wysokosprawna chromatografia cieczowa

Chromatografii w wysokosprawnej chromatografii cieczowej ( HPLC ) - ale najczęściej jest to skrót HPLC ( wysokosprawna chromatografia cieczowa lub rzadziej wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa ) z 1990 roku  - jest to technika rozdziału analitycznego i / lub preparatywnej cząsteczek obecnych w mieszanina. Umożliwia to dostosowanie zwykłych metod chromatograficznych (patrz kolumna) do zestawu wysokociśnieniowego.

Ta forma chromatografii jest często stosowana w biochemii , jak również w chemii analitycznej .

P w akronimie, pierwotnie oznaczało ciśnienie, ale gdy metoda została ulepszona (redukcja cząstek i regulacja fazy stacjonarnej), P przypisano Performance, aby zaznaczyć tę innowację.

Zasada

Próbka do analizy jest popychana przez ciecz (zwaną fazą ruchomą) do kolumny wypełnionej fazą stacjonarną o drobnym rozmiarze cząstek ("ziarna" są bardzo małe). Szybkość przepływu fazy ruchomej jest wysoka, co powoduje wzrost ciśnienia w układzie. To wysokie natężenie przepływu skraca czas wymagany do oddzielenia składników wzdłuż fazy stacjonarnej. Drobna wielkość cząstek fazy stacjonarnej umożliwia lepsze rozdzielenie składników. Rzeczywiście, dla tej samej objętości fazy stacjonarnej, powierzchnia wymiany zwiększa się, jeśli „ziarna”, które ją tworzą, mają mniejszą średnicę. Uzyskane piki (za pomocą detektora UV (białka absorbują przy 275-280  nm ) połączonego z systemem integracji i obliczeń) są węższe, dzięki czemu poprawia się rozdzielczość (piki są dobrze rozdzielone, dzięki czemu można je łatwo zobaczyć. rozróżnić), próg detekcji jest również niższy (wąskie i wysokie piki są łatwiejsze do wyizolowania z szumu tła niż szerokie i niskie piki). Połączenie tych atrybutów – dużej szybkości i rozdzielczości – prowadzi do określenia „wysoka wydajność”.
Fazy ruchome stosowane są mieszaniny wody i rozpuszczalnika organicznego (acetonitryl, metanol) lub kombinacji rozpuszczalników organicznych (alkohole, heksan, dichlorometan ,  itp ), mieszalne ze sobą.
Często skład fazy ruchomej jest modyfikowany w trakcie analizy, jest to tzw. tryb „gradientowy” lub „stopniowa elucja” (w przeciwieństwie do trybu „izokratycznego”, dla którego skład fazy ruchomej pozostaje taki sam nawet podczas separacji).

Na przykład, na niepolarnej kolumnie, stosując mieszaninę woda/metanol jako fazę ruchomą, najbardziej hydrofobowe składniki są eluowane wysokim stężeniem metanolu, podczas gdy bardziej hydrofilowe składniki są korzystnie eluowane niskim stężeniem metanolu. W zależności od charakteru fazy stacjonarnej i charakteru rozdzielanych związków, zaczyna się od wysokiego stężenia metanolu lub odwrotnie. HPLC to zastosowanie do wszystkich metod chromatograficznych: adsorpcji , partycji , filtracji żelowej , jonowymiennej , powinowactwa ,  itd.

Aparatura i działanie

Pompa

Jest to część, która służy do przechowywania eluentu i wstrzykiwania go pod ciśnieniem do kolumny. Jest wykonana z:

• dwa tłoki posuwisto-zwrotne ;
• zbiorniki fazy ruchomej ;
• zawory elektromagnetyczne  ;
• tłumik pulsacji;
• układ przedmuchiwania i zalewania  ;
• czujnik ciśnienia .

Jedna pompa jest używana do elucji izokratycznej lub kilka do elucji gradientowej .

Wtryskiwacz

Rurki ze stali nierdzewnej, teflonu , PEEK lub topionej krzemionki są używane do podłączenia pompy (pomp) do wtryskiwacza chromatograficznego. Istnieje kilka rodzajów wtryskiwaczy:

• pętla wtryskowa: umożliwia powtarzalność objętości wtrysku;
• iniektor strzykawki;
• ekstrakcja w fazie stałej online.

Detektor

Istnieje kilka rodzajów detektorów:

• detektory spektroskopowe  :
  • metodą spektroskopii absorpcyjnej  : w nadfiolecie (w tym detektor z matrycą diodową (DAD lub PDA)) lub w podczerwieni ,
  • metodą spektroskopii fluorescencyjnej  ;
• refraktometria  ;
• detektory elektrochemiczne (DEC):
  • amperometryczny ,
  • kulometryczny ,
  • polarograficzny ,
  • potencjometryczny  ;
• konduktometria  ;
• detektor rozpraszania światła przez ewaporację (ELSD);
• detekcja spektralna ze sprzężeniem:
  • do spektrometrii masowej (MS) z chromatografią cieczową – spektrometrią masową ,
  • do spektroskopii atomowej .

Odgazowywacz

Jak sama nazwa wskazuje, składnik ten usuwa gaz (dwutlenek) obecny w rozpuszczalniku (rozpuszczalnikach), aby uniknąć uszkodzenia próbek lub fazy stacjonarnej. W HPLC stosowane są dwa rodzaje odgazowywaczy:

• Odgazowywacz gazu obojętnego  : gaz obojętny jest przepuszczany przez PM (faza ruchoma) w celu usunięcia gazu rozpuszczonego w cieczy. Hel jest najczęściej używanym gazem obojętnym do tego zastosowania;
• odgazowywacz próżniowy  : metoda ta polega na obniżeniu ciśnienia w komorze, w której znajduje się rozpuszczalnik, za pomocą pierwotnej pompy próżniowej, a tym samym oddzieleniu gazu rozpuszczonego w płynie. Jest znacznie wydajniejsza, nie wymaga już gazu obojętnego i coraz częściej zastępuje starą technikę w dziedzinie analizy HPLC. Ciśnienie w obudowie jest rzędu milibarów.

Rodzaje

Istnieje kilka rodzajów chromatografii cieczowej. Charakter fazy stacjonarnej zależy od rodzaju chromatografii cieczowej, którą chcemy wykonać, a także charakteru i liczby związków, które chcemy rozdzielić.

Chromatografia adsorpcyjna

W tej chromatografii faza stacjonarna składa się z materiału stałego o dużej mocy adsorpcji, takiego jak tlenek glinu, krzemiany magnezu, żele krzemionkowe. Składniki są po prostu mniej lub bardziej zatrzymywane na powierzchni fazy stacjonarnej przez fizyczną adsorpcję . Jest to technika uwzględniająca polaryzację komponentów.

Chromatografia partycyjna

W tej chromatografii anality rozdziela się zgodnie z ich powinowactwem z fazą stacjonarną i ruchomą. Powinowactwo zależy od polarności analitów i faz. W trybie normalnym faza stacjonarna jest polarna, w trybie odwróconym jest niepolarna. Istnieją dwa rodzaje chromatografii partycyjnej:

• ciecz - ciecz  : faza stacjonarna składa się z bardzo cienkiej warstwy cieczy rozprowadzanej przez fizyczną adsorpcję na powierzchni możliwie najbardziej obojętnego materiału nośnika. Składniki są rozdzielane jak w ekstrakcji ciecz-ciecz , z tym wyjątkiem, że składniki są rozprowadzane podczas przejścia w fazie ciekłej, a nie przez mieszanie;
• faza ciekła-stała lub ciekła-szczepiona  : faza stacjonarna składa się z substancji organicznych połączonych wiązaniami chemicznymi z powierzchnią cząstek materiału nośnika.

Chromatografia w fazie normalnej

Chromatografia w normalnych fazach (NPLC) polega na rozdzielaniu różnych analitów zgodnie z ich polarnością. Ta technika separacji wywodzi się z doświadczenia Tswetta i jego konfiguracji chromatograficznej wykonanej z pigmentów roślinnych. Z biegiem lat ta ostatnia była dalej rozwijana, aby rozdzielać coraz bardziej złożone mieszaniny, zmieniając polaryzację faz i ulepszając metodologię separacji analitycznej (dodanie pompy w celu zwiększenia ciśnienia w systemie i przyspieszenia elucji, automatyzacji procesu  itp .). Opiera się to na oddziaływaniach hydrofilowych i powinowactwach analitu do fazy ruchomej i stacjonarnej w celu oddzielenia ich zgodnie z ich polarnością.

Zasada

Chromatografia w normalnych fazach (NPLC) jest rodzajem chromatografii, która obejmuje oddziaływania polarne, w przeciwieństwie do chromatografii z odwróconymi fazami (RPLC), która obejmuje oddziaływania hydrofobowe. Jest to mechanizm współzawodnictwa między zatrzymaniem substancji rozpuszczonej w fazie stacjonarnej a elucją substancji rozpuszczonej w fazie ruchomej, a zatem powinowactwa każdego analitu do fazy ruchomej i fazy stacjonarnej. Przez kolumnę przepuszcza się zatem rozpuszczalnik niepolarny lub umiarkowanie polarny. Większość zatrzymanych substancji rozpuszczonych w fazie stacjonarnej będzie eluować jako ostatnia, podczas gdy mniej zatrzymanych substancji rozpuszczonych będzie eluować jako pierwsza. Wykorzystywane są różne rodzaje interakcji, takie jak mostki wodorowe, interakcje dipol-dipol oraz interakcje kwasowo-zasadowe.

Fazy ​​stacjonarne

Fazy ​​stacjonarne stosowane do chromatografii w normalnych fazach są fazami polarnymi. Zaletą tej chromatografii jest możliwość modyfikacji oddziaływań, zarówno tych między analitami a fazą stacjonarną, jak i tych z analitami i fazą ruchomą oraz fazy ruchomej z fazą stacjonarną. Ponieważ analit porusza się zgodnie ze swoim powinowactwem do fazy ruchomej i fazy stacjonarnej, możliwe jest wybranie dwóch faz w celu optymalizacji rozdziału złożonego układu. Krzemionkę można stosować bezpośrednio, ponieważ zawiera na powierzchni grupy silanolowe (Si-OH). W zależności od metody zastosowanej do syntezy krzemionki powierzchnia właściwa cząstek, średnica cząstek, a także średnica porów są bardzo zróżnicowane. Każdy rodzaj krzemionki ma swoje własne właściwości separacyjne. Rodzaje krzemionek zawierających więcej wolnych grup silanolowych (bardziej kwaśnych) lub mniej grup silanolowych mogą być również stosowane w zależności od pożądanego typu rozdzielania. Możliwe jest również sfunkcjonalizowanie krzemionki w celu zmiany polarności lub charakteru krzemionki na powierzchni, jednocześnie czyniąc jej powierzchnię bardziej jednorodną. W zależności od rodzaju separacji, którą chce się przeprowadzić, należy wybrać jedną z trzech klas sfunkcjonalizowanej krzemionki zgodnie z następującym trójkątem selektywności:

1. akceptor protonów;
2. Donor protonów;
3. Oddziaływania dipol-dipol.

Jeśli rozdział nie działa z jednym rodzajem krzemionki, wybierany jest drugi typ, który należy do innej klasy, aby wygenerować najbardziej drastyczną zmianę w interakcjach między fazą stacjonarną a analitami. Funkcjonalizowane krzemionki najczęściej stosowane do chromatografii w normalnych fazach to krzemionka cyjanopropylowana, krzemionka aminopropylowana i krzemionka 1,2-hydroksypropylowana (diol). Inne grupy można również wykorzystać do funkcjonalizacji krzemionki do bardziej specyficznych zastosowań, ale na ogół są one wystarczające. Kolumna diolowa jest kolumną kwasową, kolumna aminowa jest kolumną dość zasadową, podczas gdy kolumna cyjanowa ma umiarkowane oddziaływania dipolowe dipolowe.

Faza mobilna

Stosowane rozpuszczalniki są takie same jak te stosowane w innych typach chromatografii. Idealnie stosuje się rozpuszczalniki o niskiej lepkości, aby umożliwić wyższą szybkość przepływu eluentu w kolumnie, która ma niską temperaturę wrzenia, aby ułatwić odzyskiwanie analitów po elucji. Ponadto, aby przeprowadzić chromatografię, rozpuszczalnik musi być bezwzględnie mniej polarny niż anality, aby uniknąć bezpośredniej elucji analitów. Ogólnie, jako podstawowy niepolarny rozpuszczalnik stosuje się heksan lub pentan (określany jako Rozpuszczalnik A). Możliwe jest granie na polarność eluentu poprzez zmianę polarności rozpuszczalnika A. Z drugiej strony, prościej jest zastosować eluent binarny, ponieważ polarność będzie się zmieniać w zależności od ilości dodanego rozpuszczalnika polarnego. Powszechnie stosowanymi rozpuszczalnikami polarnymi, zwanymi również rozpuszczalnikami modyfikującymi (rozpuszczalnik B) są chloroform, dichlorometan, octan etylu, tetrahydrofuran, eter metylowo-tert-butylowy (MTBE), eter dietylowy oraz alkohole, takie jak metanol czy izopropanol.

Innym ważnym czynnikiem dotyczącym fazy ruchomej jest siła rozpuszczalnika. Ponieważ technika opiera się na różnych interakcjach między analitami, fazą ruchomą i fazą stacjonarną, ważne jest zatem dostosowanie mocy eluentu, która jest definiowana przez powinowactwo fazy ruchomej do fazy stacjonarnej. Zatem rozpuszczalnik, którego siła elucji jest większa niż inny, będzie miał łatwiej przeciąganie analitu do fazy ruchomej, ponieważ jego oddziaływania będą silniejsze z fazą stacjonarną. Nie istnieje bezwzględna skala siły rozpuszczalnika, ponieważ zmienia się ona w zależności od kolumny. Z drugiej strony, kilka skal empirycznych umożliwia klasyfikację rozpuszczalników w kolejności odpowiadającej ich sile rozpuszczalnika (ɛ 0 ). W przypadku mieszaniny rozpuszczalników moc rozpuszczalnika nie wzrasta liniowo wraz z procentem dodanego rozpuszczalnika polarnego. Z drugiej strony można go obliczyć za pomocą następującego równania:

εWb=εW+log⁡(NIEb10αnieb(εb-εW))+1-NIEbαnieb{\ displaystyle \ epsilon _ {AB} = \ epsilon _ {A} + {\ frac {\ log \ lewo (N_ {B} {10} ^ {\ alfa \, n {_ {B}} \ lewo (\ epsilon _ {B} - \ epsilon _ {A} \ po prawej)} \ po prawej) + 1-N_ {B}} {\ alfa n_ {B}}}}

Gdzie ε AB to moc mieszaniny rozpuszczalników, ε A i ε B to moc rozpuszczalnika odpowiednio każdego z czystych rozpuszczalników A i B, NB to ułamek molowy, a n B to obszar cząsteczkowy rozpuszczalnika modyfikującego a α to współczynnik aktywności, zwykle 1 dla nowoczesnej kolumny analitycznej. Jeśli chcesz zoptymalizować rozdział, ważne jest, aby zachować tę samą moc rozpuszczalnika po zmianie rozpuszczalnika B.

Selektywność rozpuszczalników

Selektywność rozpuszczalnika to zestaw oddziaływań kwas-zasada, dipol-dipol i wiązania wodorowe między cząsteczkami rozpuszczalnika a analitem. Zachodzi zmiana selektywności rozpuszczalnika, gdy oddziaływania molekularne między fazą stacjonarną, substancją rozpuszczoną i fazą ruchomą zmieniają się gwałtownie wraz ze zmianą rozpuszczalnika. Selektywność rozpuszczalnika opiera się na trójkącie selektywności Snydera, który kieruje wyborem rozpuszczalnika lub rozpuszczalników, a także fazy stacjonarnej w celu optymalizacji rozdziału analitu. Każdy wierzchołek trójkąta reprezentuje charakterystykę rozpuszczalnika, albo akceptora protonów, donora protonów albo posiadającego dipol. Rozpuszczalniki są klasyfikowane w trójkącie, tak aby sklasyfikować je zgodnie z możliwymi interakcjami rozpuszczalnika z analitem. Aby nagle zmienić interakcje między rozpuszczalnikiem a analitami, wystarczy przełączyć się z rozpuszczalnika w pobliżu jednego wierzchołka trójkąta na rozpuszczalnik, który znajduje się bliżej innego wierzchołka.

Efekt offshoringu (przemieszczenie)

Efekt lokalizacji jest efektem nie do pominięcia w NPLC. Kiedy polarna substancja rozpuszczona może oddziaływać silnie (mostek dipolowy lub wodorowy) z grupami funkcyjnymi na powierzchni krzemionki, mówimy, że substancja rozpuszczona „lokalizuje”. Rzeczywiście, substancja rozpuszczona ma zdolność lokalizacji, która jest podawana jako funkcja efektywnej powierzchni grupy na powierzchni krzemionki. Powierzchnię tę można zmniejszyć przez działanie rozpuszczalnika modyfikującego, który w konkurencji z substancją rozpuszczoną wywiera silne oddziaływania tego samego typu. Im więcej interakcji rozpuszczalnika z grupami powierzchniowymi, tym bardziej zmniejsza się zatrzymywanie substancji rozpuszczonej. Rozpuszczalnik może zatem szybciej eluować substancję rozpuszczoną w kolumnie, jeśli jego oddziaływania z fazą stacjonarną są wystarczające do przeciwdziałania oddziaływaniom substancji rozpuszczonej; mówi się, że ma efekt relokacji. Czasami efekt delokalizacji przeważa nad kwasowością, zasadowością lub dipolarnością rozpuszczalnika. Dlatego ma duży wpływ na zatrzymywanie substancji rozpuszczonych.

Skutki uboczne rozpuszczalnika

Inny rodzaj efektu dotyczy interakcji między rozpuszczalnikiem a substancją rozpuszczoną. Są to tak zwane efekty uboczne rozpuszczalnika. Efekty te mogą w niektórych przypadkach poprawić retencję substancji rozpuszczonych, w innych ją utrudnić. Pierwszy rodzaj efektu ubocznego rozpuszczalnika występuje, gdy rozpuszczalnik oddziałuje bezpośrednio z substancją rozpuszczoną. Siła retencji jest zatem rozłożona, a faza stacjonarna ma trudności z przeciwdziałaniem tym efektom, co powoduje zmniejszenie retencji. Drugi efekt uboczny występuje, gdy stężenie rozpuszczalnika modyfikującego jest wyższe w fazie stacjonarnej niż w fazie ruchomej. Gdy substancja rozpuszczona silnie oddziałuje z rozpuszczalnikiem modyfikującym, efekt ten jest korzystny i zwiększa retencję substancji rozpuszczonej. Trzecim efektem ubocznym jest taka siła między rozpuszczalnikiem modyfikującym a fazą stacjonarną, że rozpuszczalnik modyfikujący jest zawadą przestrzenną, co zmniejsza retencję, ponieważ rozpuszczalnik modyfikujący w fazie ruchomej może nadal oddziaływać z substancją rozpuszczoną.

Chromatografia z odwróconą fazą

Podstawa fazy odwróconej jest w normalnym układzie faz, na których łańcuchy alkilowe (lub inne w zależności od wymaganej polaryzacji) są szczepione na poziomie silanolowych grupami ( kończąca ). Na ogół faza stacjonarna składa się głównie z małych cząstek krzemionki, na których wszczepiono funkcje chemiczne, najczęściej z łańcuchów alkilowych o 8 lub 18 atomach węgla.
Funkcje silanolu (Si-OH), które pozostają, generują pasożytnicze oddziaływania hydrofilowe, co sprawia, że ​​wyniki są nieodtwarzalne, zwłaszcza w przypadku podstawowych cząsteczek. Aby tego uniknąć, na powierzchni krzemionki jest zwykle pokryta funkcji metylu i funkcje silanolowe nie wolne, ale w postaci (Si-O-CH, 3 ), to ten etap, który nazywany jest "  wycofanych przykrycie  ”. Funkcje chemiczne stosowane do zakańczania mogą mieć jednak bardzo różnorodny charakter, a kolumny najnowszej generacji odporne na ekstremalne pH są zazwyczaj zakańczane funkcjami oferującymi większy gen steryczny, takimi jak tert-butyl (Si-OC (CH 3 ) 3 ).

W zależności od szybkości szczepienia uzyskuje się większą lub mniejszą rozdzielczość.

Ta stacjonarna faza nazywana jest „odwróconą” ze względu na polarność i hydrofilowość (bez „przeszczepów”), faza staje się niepolarna i hydrofobowa.

Chromatografia jonowymienna

Faza stała jest nierozpuszczalną żywicą zaopatrzoną w grupy funkcyjne zdolne do dysocjacji. Są to zwykle „  kwas sulfonowy  (SO” 3 H) grupy wymienniki kationów i „  czwartorzędowa amoniowa  ” (N (R) 3 ) wymienników anionowych.

Chromatografia wykluczania wielkości

Składniki są rozdzielone zgodnie z ich wielkością cząsteczkową. Faza stacjonarna składa się z materiału porowatego (małe cząstki krzemionki lub polimerów), cząsteczki o średnicy większej niż średnica porów nie mogą wnikać i nie są zatrzymywane. Czas przebywania w kolumnie zwiększa się wraz ze zmniejszaniem się wielkości analitów.

Chromatografia chiralna

Ta technika chromatograficzna polega na tworzeniu wiązań niekowalencyjnych pomiędzy enancjomerami substratu i chiralnym absorbentem chromatograficznym, dając kompleksy diastereomeryczne o różnych powinowactwach wiązań. Jest zatem stosowany w szczególności do oddzielania enancjomerów.

Parametry chromatograficzne

Jakość i czas trwania separacji mogą się zmieniać wraz z charakterem stosowanej fazy stacjonarnej i fazy ruchomej. Ale dla tego samego typu fazy stacjonarnej i tej samej fazy ruchomej jakość i czas trwania separacji można również modyfikować przez charakterystykę geometryczną i roboczą tych dwóch faz.

Charakterystyki geometryczne fazy stacjonarnej

• Długość L i średnica wewnętrzna d c kolumny.
• Średnica cząstek fazy stacjonarnej d p .

Charakterystyki operacyjne fazy ruchomej

• Prędkość liniowa przepływu u .
• Spadek ciśnienia lub przyłożone ciśnienie ΔP między wlotem a wylotem kolumny (ciśnienie wylotowe jest ogólnie atmosferyczne). Daje to prawo Darcy'ego

ΔP=Φ⋅η⋅L⋅tyrep2{\ displaystyle \ Delta P = \ Phi \ cdot {\ frac {\ eta \ cdot L \ cdot u} {{d_ {p}} ^ {2}}}}

gdzie to lepkość fazy ruchomej, a Φ to współczynnik oporów przepływu zależny od kształtu cząstek i jakości wypełnienia fazy stacjonarnej. W przypadku kolumn dobrze wypełnionych sferycznymi lub nieregularnymi cząstkami, wzór empiryczny Vérillonaη{\ styl wyświetlania \ eta}

ΔP(MPa)=400⋅fa(ml / min)⋅L(cm)⋅η(cP)rep(µm)2⋅revs(mm)2{\ displaystyle \ Delta P \; ({\ tekst {MPa}}) = 400 \ cdot {\ frac {F \; ({\ tekst {ml / min}}) \ cdot L \; ({\ tekst {cm }}) \ cdot \ eta \; ({\ text {cP}})} {{d_ {p} \; ({\ text {µm}})} ^ {2} \ cdot {d_ {c} \; ({\ tekst {mm}})} ^ {2}}}}

ustalone za pomocą zwykłych jednostek, pozwala na wygodne obliczenie oszacowania ΔP w funkcji natężenia przepływu F fazy ruchomej z niepewnością mniejszą niż 25% i w szerokim zakresie warunków pracy (2  μm < d p <50  μm , 1  mm < d c < 100  mm ) do chromatografii cieczowej i nadkrytycznej.

Uwaga: prawo Darcy'ego jest dla hydrauliki tym, czym prawo Ohma dla elektryczności. Ciśnienie hydrauliczne jest analogiczne do potencjału elektrycznego, przepływ cieczy jest analogiczny do natężenia prądu, przepuszczalność hydrauliczna jest analogiczna do przewodności elektrycznej, zwiększanie ciśnienia i obniżanie ciśnienia kolumny chromatograficznej są analogiczne do odpowiednio obciążenia i obciążenia, rozładowania kondensatora elektrycznego.

Wielkości charakterystyczne w chromatografii

Obserwowalny wynik analizy HPLC ma postać krzywej sygnału wykrytego w funkcji czasu: to jest chromatogram . Ma kilka szczytów w kształcie Gaussa, o różnych cechach:

• czas retencji lub t R , razem z maksimum piku. Czas t 0 lub zero retencji nazywamy czasem odpowiadającym związkowi, który nie został zatrzymany chromatograficznie;
• szerokość piku, mierzona w połowie wysokości: ω 1/2 , lub u jego podstawy, przez przecięcie stycznych piku w jego punktach przegięcia z linią bazową  : ω .

Stamtąd można obliczyć kilka cech kolumny do separacji pików:

• współczynnik retencji k ' szczyt, według wzoru

k'=tR-t0t0{\ displaystyle k '= {\ frac {t_ {R} -t_ {0}} {t_ {0}}}}

• wydajność N lub liczbę półek teoretycznych , w stosunku do szerokości piku o wzorze

NIE=16⋅tR2w2=5,54⋅tR2w1/22{\ displaystyle N = 16 \ cdot {\ frac {t_ {R} ^ {2}} {w ^ {2}}} = 5,54 \ cdot {\ frac {t_ {R} ^ {2}} {w_ {1 /2} ^ {2}}}} Ta wartość mierzy rozdrobnienie piku. Z tej wartości można obliczyć wysokość odpowiadającą półce teoretycznej (HEPT) H , co pozwala na porównanie słupów o różnej długości H=LNIE{\ displaystyle H = {\ frac {L} {N}}}

• selektywność α pomiędzy dwoma pikami 1 i 2 (2 jest bardziej zatrzymywane, niż 1), zdefiniowany jako stosunek ich dwóch czynników zatrzymujących

α=k2'k1'{\ displaystyle \ alfa = {\ frac {k '_ {2}} {k' _ {1}}}} Mierzy zdolność kolumny do oddzielania maksimów od pików. Im więcej jest większe niż 1, tym dłuższe są czasy retencji;

• rozdzielczości R S pomiędzy pikami 1 i 2

RS=2⋅tR2-tR1w1+w2{\ displaystyle R_ {S} = 2 \ cdot {\ frac {t_ {R2} -t_ {R1}} {w_ {1} + w_ {2}}}} Ta wartość mierzy jakość separacji i brak nakładania się dwóch rozważanych pików. Tak zdefiniowana rozdzielczość jest celem rozdziału chromatograficznego. Jest to funkcja trzech cech (wydajności, selektywności i retencji), zdefiniowanych powyżej, których wyrazem jest: RS1,2=14⋅NIE⋅α-1α⋅k2'1+k1'{\ displaystyle R_ {S1,2} = {\ frac {1} {4}} \ cdot {\ sqrt {N}} \ cdot {\ frac {\ alfa -1} {\ alfa}} \ cdot {\ frac {k '_ {2}} {1} + k _ {1}}}} Wyrażenie to pokazuje w szczególności, że tę samą rozdzielczość można uzyskać w warunkach chromatograficznych albo bardzo skutecznych (optymalizacja kinetyczna), albo bardzo selektywnych (optymalizacja termodynamiczna).

W każdym razie wydajność charakteryzująca technikę HPLC jest określona przez zdolność rozdzielczą na jednostkę czasu, co nie oznacza systematycznie stosowania najwyższego możliwego ciśnienia.

Uwagi i referencje

1. Wyniki pobierania próbek kannabinoidów z oleju CBD za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) w połączeniu z detekcją UV - Naturicious .
2. (en) William T. Cooper, Chromatografia cieczowa w normalnych fazach , Encyklopedia chemii analitycznej ,2006.
3. (w) Snyder, LR i Kirkland, JJ, Wprowadzenie do nowoczesnej chromatografii , John Wiley & Sons ,1979, 2 II  wyd.
4. (w) Johnson, Andrew R. i Vitha, Mark F., „  Trójkąty selektywności chromatograficznej  ” , Journal of Chromatography A , tom.  1218, nr 42011, s.559-560.
5. JL Cuq, 2007, Chromatografia cieczowa , University of Montpellier 2, s.  13-14 .

Powiązane artykuły

• UPLC (Ultra wydajna chromatografia cieczowa)
• Lista akronimów biologii komórkowej i molekularnej
• Techniki biologii molekularnej

<img src="https://fr.wikipedia.org/wiki/Special:CentralAutoLogin/start?type=1x1" alt="" title="" width="1" height="1" style="border: none; position: absolute;">