U eukariontów ( organizmów do rdzenia ) splicing jest procesem, w którym RNA transkrybowany z genomu DNA może przejść etapy cięcia i ligacji, które prowadzą do eliminacji pewnych regionów w końcowym RNA. Segmenty, które są konserwowane, nazywane są eksonami, a te, które są usuwane, nazywane są intronami .
Zatem geny składają się z naprzemiennych serii eksonów i intronów; obserwuje się to głównie w genach kodujących białka , ale także w niektórych niekodujących genach RNA , takich jak tRNA .
Podczas transkrypcji genów kodujących białka syntetyzowany jest pre-informacyjny RNA, który następnie jest składany do jądra komórki, dając początek tak zwanemu dojrzałemu informacyjnemu RNA . Dojrzałe mRNA, składające się z jedynych eksonów, jest następnie eksportowane do cytoplazmy w celu translacji do białka.
Wykazano, że mechanizmy kontrolne zapewniają prawidłowy splicing mRNA przed zezwoleniem na ich eksport.
Splicing jest katalizowany przez zestaw kompleksu rybonukleoprotein zwanego zbiorczo spliceosomem (splicing mówiący po angielsku splicing ). Każdy kompleks, zwany małą jądrową rybonukleoproteiną , zawiera RNA i kilka białek. Składanie mRNA jest również katalizowane przez snRNA (małe jądrowe RNA), które są małymi niekodującymi RNA związanymi z białkami.
Istnieją również introny zwane samosplicingami lub autokatalitycznymi, tj. Zdolne do wycięcia bez interwencji spliceosomu, w mitochondriach , plastydach i niektórych bakteriach . Jednak przynajmniej w mitochondriach i chloroplastach niektóre z tych intronów wymagają interwencji białek jądrowych.
Mechanizm katalityczny spliceosomu jest nadal niedokładnie poznany, ale przez analogię do funkcjonowania rybosomu uważa się, że katalityczny jest RNA (a zatem spliceosom jest rybozymem ).
Splicing jest znacznie dłuższy niż transkrypcja, ta ostatnia trwa kilka minut w porównaniu do około półtorej godziny w przypadku splicingu.
Połączenia intron / egzon zawierają charakterystyczne sekwencje nukleotydowe, które są konserwatywne. Sekwencje te są rozpoznawane przez spliceosom. Intron zawiera również wewnętrzną sekwencję, zwaną ramką rozgałęzienia . Ta puszka rozgałęzienia zawiera adenozynę, która odgrywa kluczową rolę w procesie splicingu.
Właściwy splicing odbywa się w dwóch etapach, przede wszystkim jest to atak nukleofilowy 2′-OH rybozy adenozyny z rozgałęzienia prostokąta na fosforan połączenia ekson-intron w 5 ′. Po tym rozszczepieniu 3'-OH uwolniony na poziomie egzonu górnego atakuje fosforan połączenia intron-ekson poniżej. Produktami tej reakcji są z jednej strony dwa egzony prawidłowo zligowane, az drugiej strony intron cyklizowany na poziomie adenozyny w skrzynce rozgałęziającej. Ze względu na swój szczególny kształt ta forma intronu nazywana jest lasso (en: lariat ). Lasso jest ostatecznie otwierane przez enzym rozłączający, aby można go było poddać recyklingowi
Małe rybonukleoproteina jądrowego (snrnp lub pRNPn) są składnikami spliceosomu występującego w jądrze w komórkach eukariontów . Proces splatania kanonicznego wykorzystuje pięć pRNPn, zwanych U1, U2, U4, U5 i U6. Każdy z tych pRNPn składa się z RNA, zwanego pnRNA , który przyjmuje określoną strukturę drugorzędową i trzeciorzędową oraz kilka białek. Wśród powiązanych białek niektóre są wspólne dla wszystkich pRNPn, a inne są specyficzne dla każdego z nich. Typowe białka nazywane są białkami Sm , których jest siedem i łączą się, tworząc heptameryczny pierścień otaczający segment snRNA .
Liczba specyficznych białek jest różna, na przykład są trzy dla U1: U1A, U1C i U1-70K.
Proces splicingu jest dynamicznym mechanizmem, który następuje po precyzyjnej sekwencji zdarzeń, podczas których różne małe jądrowe rybonukleoproteiny składają się i odłączają od spliceosomu . Sekwencja jest następująca:
Większość interakcji między mRNA i małymi jądrowymi rybonukleoproteinami obejmuje podstawowe pary między częściami komplementarnych sekwencji nukleotydowych. Tak więc, na przykład, snRNA U1 zawiera sekwencję komplementarną do sekwencji konsensusowej znalezionej w miejscu połączenia ekson-intron na 5 ', co pozwala mu na wiązanie się z tym regionem pre-informacyjnego RNA. Istnieją również pary RNA-RNA między różnymi snRNA.
Stwierdzono, że niewielka liczba nietypowych intronów została połączona przez drugi spliceosom, zwany mniejszym spliceosomem . Te introny są czasami nazywane intronami ATAC, ponieważ pierwsze odkryte z obu stron graniczyły z sekwencjami AT (5 ') i AC (3') zamiast konserwatywnych sekwencji GU (5 ').' ') I AG ( w 3 ') klasycznych intronów. Mniejszy spliceosom działa w podobny sposób jak klasyczny spliceosom, ale z innymi małymi jądrowymi białkami rybonukleoproteinowymi: U11, U12, U4atac i U6atac, które zastępują U1, U2, U4 i U6. Z drugiej strony mniejszy spliceosom wykorzystuje U5, podobnie jak główny spliceosom.
W kilku rodzajów organizmów ( pierwotniaki , grzyby , rośliny ), niektóre intronach RNA nie potrzebują spliceosomu dla ich wycięciu, są one w stanie zapewnić własne składanie autonomicznie ( self-forniru introny ), bez interwencji snrnp. Szczególnie często występują w RNA wytwarzanych w organellach (mitochondriach i chloroplastach): mRNA , tRNA i rRNA . Te introny są wysoce ustrukturyzowane i mają wewnętrzną aktywność katalityczną, są rybozymami . Niektóre z tych intronów są całkowicie autonomiczne, a inne wymagają interwencji białek pomocniczych.
Na podstawie ich trójwymiarowej struktury zidentyfikowano dwie główne rodziny intronów autokatalitycznych: introny grupy I i introny grupy II. Introny grupy II wykazują strukturalne podobieństwo do RNA snRNP spliceosomu i uważa się, że mogą pochodzić z tego samego źródła. Introny grupy II katalizują, na przykład, wycięcie wytwarzające strukturę lassa, tak jak ma to miejsce w przypadku klasycznego spliceosomu: introny z GII zwijają się, aby przeprowadzić dwie estryfikacje. Otrzymujemy zatem z jednej strony rozszczepiony intron, az drugiej spawane egzony.
Alternatywne splicing zaobserwowano po raz pierwszy w 1977 roku i jest jednym z najbardziej złożonych mechanizmów u eukariontów. Naukowcy odkryli, że pierwszy transkrybowany RNA wyprodukowany przez wirusa adenowirusa typu 2 w jego późnej fazie przeszedł różne ścieżki splicingu, dając początek mRNA kodującym różne białka wirusowe. W 1981 roku scharakteryzowano pierwszy przykład alternatywnego transkryptu splicingu, endogennego „normalnego” genu. Zespół naukowców odkrył, że gen kodujący kalcytoninę, hormon tarczycy, ulega alternatywnemu splicingowi w komórkach ssaków. Od tego czasu alternatywny splicing został uznany za wszechobecny w komórkach ssaków.
Spliceosom rozpoznaje sygnały składania, tak jak w przypadku sygnału radiowego, te sygnały składania są mniej lub bardziej silne, co oznacza, że spliceosom rozpoznaje je lepiej lub gorzej.
Sygnały te są po prostu specyficznymi sekwencjami nukleotydów.
Słabe sygnały nazywane są „alternatywnymi sygnałami splicingu”. Pozwalają one na złożenie pre-mRNA w kilka dojrzałych mRNA . Natomiast silne sygnały nazywane są „sygnałami konstytutywnymi”.
W ten sposób gen może kodować kilka białek. Alternatywny splicing odgrywa bardzo ważną rolę w rozwoju komórek , organizacji tkanek, a nawet w rozwoju jednostki. (na przykład: gen Slx odpowiedzialny za różnicowanie płci u Drosophila). „Uważa się, że co najmniej 70% z około 30 000 genów tworzących ludzki genom podlega alternatywnemu splicingowi i że średnio jeden gen daje początek 4 wariantom wynikającym z takiego splicingu, prawdopodobnie dając początek około 100 000 białek, które różnią się kolejnością, a tym samym czynnościami. „ Dogmat„ jeden gen, jedno białko ”nie jest generalnie ważny, a„ 1 gen, białko ”dłużej odpowiada rzeczywistości.
W niektórych ekstremalnych przypadkach alternatywny splicing pozwala jednemu genowi kodować więcej białek niż wszystkie inne razem wzięte. Tak jest w przypadku Dscam u Drosophila, który może zakodować do 38016 różnych informacyjnych RNA.
Ogólnie rozróżnia się pięć alternatywnych trybów łączenia:
Oprócz pięciu trybów wymienionych powyżej, następujące zdarzenia wytwarzają szeroką gamę alternatywnych białek:
Zaproponowano, że u eukariontów alternatywny splicing jest bardzo ważnym krokiem w kierunku większej wydajności, ponieważ informacje można „przechowywać” w sposób bardziej ekonomiczny. Jeden gen może kodować kilka białek, co prowadzi do powstania alternatywnego proteomu. Proteom alternatywny to zestaw alternatywnych białek wytwarzanych przez organizm i stanowi część proteomu. Badanie alternatywnego splicingu w skali genomu jest jednym z aktualnych wyzwań stojących przed biologią molekularną. Wraz z pojawieniem się technik wysokiej rozdzielczości badanie alternatywnych zdarzeń splicingu staje się coraz łatwiejsze. Oto kilka przykładów:
Ponadto możliwa jest również analiza wyników uzyskanych z biologii molekularnej za pomocą bioinformatyki, co znacznie skraca wymagany czas analizy. Oprogramowanie takie jak: przeglądarka genomu , mapa splicingu ARN i mapa termiczna .
Alternatywny splicing jest ważnym procesem regulacji ekspresji genów. Przyczyniają się do tego dwie konsekwencje alternatywnego splicingu:
Pierwsza jest znana z inicjałów NMD Nonsense mediated decay : podczas alternatywnego składania, dodanie lub usunięcie egzonu , a nawet modyfikacja długości konkretnego egzonu (w porównaniu z mRNA „kanonicznym”) może spowodować przesunięcie w ramka odczytu (nukleotydy są odczytywane trzy na trzy przez rybosom podczas translacji), a zatem powodują przedwczesne pojawienie się kodonu STOP, co nazywa się nonsensem mutacji . Utworzone w ten sposób mRNA są rozpoznawane przez zestaw białek i degradowane przed translacją . Proces ten jest nie tylko mechanizmem „kontroli jakości”, ale także pozwala, poprzez zwiększenie wskaźnika alternatywnych splic wytwarzających przedwczesne kodony STOP, na zmniejszenie liczby białek podlegających translacji. Drugą konsekwencją jest po prostu fakt, że zmiana sekwencji mRNA ma wpływ na sekwencję białka, a zatem potencjalnie na jego właściwości fizykochemiczne, i umożliwia regulację jego funkcji. Na przykład: białko CD45 odgrywa rolę w aktywacji limfocytów T podczas odpowiedzi immunologicznej na infekcję. Kiedy limfocyty T są w spoczynku, a zatem są potencjalnie aktywowane, wyrażana jest najdłuższa forma białka (zawiera ona wszystkie dziewięć eksonów). Kiedy limfocyty T zostały właśnie aktywowane, mRNA CD45 są naprzemiennie składane i wycinane są egzony 4,5,6. Wytworzona w ten sposób postać CD45 jest zatem krótsza i nie może pełnić swojej roli aktywatora. Zapobiega to zbyt długiemu otrzymywaniu przez limfocyty T sygnału aktywującego, a tym samym wyzwalaniu nieproporcjonalnej odpowiedzi immunologicznej.
Nieprawidłowy alternatywny splicing stwierdzono również w dużej części komórek rakowych. Do tej pory nie określono, jaką rolę we wzroście komórek odgrywa nieprawidłowy alternatywny splicing. Wykazano, że to zmniejszenie alternatywnego splicingu w komórkach rakowych, w porównaniu z normalnymi komórkami, powoduje niektóre nowotwory. Ponadto komórki rakowe mają większą retencję intronów niż normalne komórki, ale mniej egzonu kasetowego.