Mutagenezy jest wywoływanie jednej lub więcej mutacji w genomie , dokładnie i woli. Ta metoda służy do modyfikowania struktur DNA , RNA i białek . Ta technika biologii molekularnej została opracowana przez Michaela Smitha w 1978 roku. Najwyraźniej pomysł mutagenezy ukierunkowanej przyszedł mu do głowy podczas rozmowy z Clyde Hutchisonem w 1976 roku w Cambridge Institute w Anglii, kiedy „pracował nad przygotowaniem oligonukleotydy do oczyszczania fragmentów DNA. To wielkie odkrycie przyniosło mu w 1993 roku Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii wraz z Karry Mullisem , wynalazcą łańcuchowej reakcji polimerazy .
Metody mutagenezy ukierunkowanej oparte są na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Mutacje wprowadza się za pomocą starterów oligonukleotydowych, które są wcześniej syntetyzowane. Te startery są komplementarne do sekwencji typu dzikiego z wyjątkiem nukleotydów, które muszą być zmutowane. Rzeczywiście, PCR nie wymaga ścisłej komplementarności między starterem nukleotydowym a docelową sekwencją DNA. Pod koniec reakcji PCR mutacje są wprowadzane do produktów i mogą być trzech typów:
1) Podstawienia: jeden lub więcej nukleotydów jest zastąpionych taką samą liczbą różnych nukleotydów.
2) Insercje: do sekwencji docelowej dodaje się jeden lub więcej nukleotydów.
3) Delecje: jeden lub więcej nukleotydów jest usuwanych z sekwencji.
Jedno z pierwszych podejść do mutagenezy ukierunkowanej jest oparte na wydłużaniu zachodzenia na siebie. Komplementarne startery są używane do generowania fragmentów DNA z nakładającymi się końcami przez PCR. Te fragmenty są łączone, a ich hybrydyzacja umożliwia wydłużenie zachodzącego regionu. Mutacje wprowadzane są w specyficzny sposób poprzez zmiany nukleotydów w sekwencji starterów.
W praktyce do wykonania trzech reakcji PCR używa się dwóch par starterów. Startery 1 i 2 niosą mutację w swoim regionie 5 'i są do siebie komplementarne. Startery 3 i 4 ograniczają DNA, który ma być amplifikowany. Pierwsza PCR jest przeprowadzana ze starterami 2 i 3 i umożliwia amplifikację lewej części docelowego DNA, w tym zmutowanego regionu. Drugi PCR, przeprowadzony ze starterami 1 i 4, wytwarza prawą część docelowego DNA, w tym zmutowany region. Oczyszczone, zmieszane i zdenaturowane produkty tych dwóch reakcji PCR mogą hybrydyzować ze zmutowanym regionem, który jest dla nich wspólny. Trzeci PCR z oligonukleotydami 3 i 4 umożliwia następnie uzyskanie pełnego docelowego DNA z mutacją.
Inne ważne podejścia obejmują ukierunkowaną mutagenezę na wektorze QuickChange.
Dzięki PCR możliwych jest wiele technik :