Cytometrii masy (lub CyTOF przez cytometrię czas przelotu) Metoda A jest analogiczna do cytometrii przepływowej do analizy populacji komórek. Podobnie jak cytometria przepływowa, cytometria masowa polega na specyficznym znakowaniu antygenów komórkowych przeciwciałami monoklonalnymi . Jednak w przeciwieństwie do cytometrii przepływowej, przeciwciała te są sprzężone z nieradioaktywnymi izotopami metali ciężkich (zamiast fluorochromów ), które są wykrywane za pomocą spektrometrii mas (zamiast fotopowielaczy ). Zastosowanie izotopów umożliwia zatem przezwyciężenie ograniczeń związanych z autofluorescencją lub nakładaniem się widm, a tym samym wykrycie większej liczby antygenów niż w cytometrii przepływowej.
Cytometr masowy może teoretycznie wykryć 135 różnych izotopów o masach atomowych w zakresie od 75 do 209 Da. W praktyce liczba izotopów, które można zastosować w cytometrii masowej jest ograniczona do 50, z jednej strony dlatego, że konieczne jest stosowanie wyłącznie izotopów niekomórkowych, az drugiej strony, ponieważ liczba izotopów wystarczająco czystych jest ograniczona. Rodzina lantanowców jest szczególnie wykorzystywana w cytometrii masowej, nie tylko dlatego, że dostępnych jest kilka izotopów z tej rodziny o czystości powyżej 95%, a metale te nie występują w komórkach, ale także dlatego, że metale z tej rodziny mają bardzo podobne właściwości chemiczne. do siebie. Izotopy sprzężone z polimerami można sprzęgać z przeciwciałami przez częściową redukcję mostków dwusiarczkowych, umożliwiając sprzężenie grupy maleimidowej na polimerach z grupami cysteina-SH na przeciwciałach. Te przeciwciała można następnie zastosować do znakowania komórek w taki sam sposób, jak w cytometrii przepływowej. Ponadto komórki można również znakować cisplatyną, aby ocenić ich żywotność, oraz cząsteczką interkalującą w DNA, aby wykryć komórki niezależnie od ich znakowania za pomocą anticorp.
Komórki przechodzą przez nebulizator, który tworzy chmurę kropelek, z których każda zawiera pojedynczą komórkę. Kropelki te są następnie jonizowane przez plazmę, tworząc chmury jonów zawierających izotopy związane z przeciwciałami, ale także różne atomy pochodzące z komórek (węgiel, azot i tlen). Przejście chmury jonów przez kwadrupolowego umożliwiają wyeliminowanie większości komórkowych elementów atomowych i zachować tylko izotopy ciężkie (> 100 Da), które są następnie oddzielane w komorze lotu i analizowane odpowiednio, ich masy atomowej do współczynnik naładowania .
Podobnie jak w przypadku cytometrii przepływowej, cytometria masowa umożliwia identyfikację precyzyjnych populacji komórek w heterogenicznej mieszaninie komórek i powiązanie jednej lub więcej populacji komórek z danym fenotypem. Jednak ilość parametrów mierzonych cytometrią masową nie pozwala na wiarygodną analizę ręczną. W szczególności liczba mierzonych parametrów odpowiada tak wielu wymiarom, a analiza napotyka problem plagi wymiaru . Aby obejść ten problem, klasyczne analizy cytometrii masowej wymagają użycia różnych algorytmów. Po pierwsze, redukcja wymiarów rzutuje informacje o każdej komórce na dwa wymiary (lub więcej w zależności od algorytmów) zgodnie z ekspresją każdego markera, zapewniając pierwszą uproszczoną wizualizację ogólnej heterogeniczności badanych populacji komórek. Różne algorytmy umożliwiają również określenie (przed lub po zmniejszeniu wymiarów) grup (klastrów lub klastrów) różnych populacji komórek.
Jedno z ograniczeń cytometrii przepływowej polega w szczególności na tym, że przeciwciała są sprzężone z fluorochromami, których widma emisji pokrywają się. Zjawisko to, zwane nakładaniem się widm, wymaga zarówno ograniczenia detekcji długości fal emitowanych przez fluorochromy za pomocą filtrów optycznych umieszczonych przed fotopowielaczami , jak i wykonania matematycznej korekty resztkowego nakładania się widm (kompensacja). W cytometrii masowej przeciwciała są sprzężone z izotopami metali ciężkich, które prawie nie wykazują żadnego nakładania się widm, co umożliwia użycie większej liczby przeciwciał (a tym samym wykrycie większej liczby różnych antygenów). Tak więc, podczas gdy liczba przeciwciał, które mogą być użyte jednocześnie w cytometrii przepływowej waha się od 8 do 25, możliwe jest użycie do 40 różnych przeciwciał w cytometrii masowej.
Podczas gdy cytometria przepływowa może określić wielkość i ziarnistość komórek (odpowiednio parametry FSC i SSC), nie jest to bezpośrednio możliwe w cytometrii masowej.
Cytometria masowa wiąże się z degradacją komórek, dlatego nie pozwala na sortowanie ich według mierzonych parametrów. Z drugiej strony, degradacja ta pociąga za sobą utratę populacji komórek wyjściowych (analizowanych jest prawie 50% populacji komórek wyjściowych), co ogranicza możliwość analizy bardzo rzadkich populacji komórek.
Akwizycja komórek w cytometrze masowym jest wolniejsza niż w cytometrze przepływowym. Dla porównania, cytometr przepływowy może zarejestrować od 2000 do 20000 komórek na sekundę, podczas gdy cytometr masowy może pobrać od 200 do 300 komórek na sekundę. Czas wymagany do uzyskania tej samej liczby komórek jest zatem dłuższy w cytometrii masowej niż w cytometrii przepływowej. Aby uniknąć zmiany sygnału spowodowanej utratą czułości cytometru masowego podczas akwizycji, do mieszaniny komórek przed akwizycją dodaje się kulki polistyrenowe w celu znormalizowania sygnału.
Sprzęganie przeciwciał z izotopami jest przeprowadzane przez polimer, który pozwala tylko na powiązanie przeciwciała z maksymalnie 100 izotopami. Intensywność sygnału odpowiadającego przeciwciałom sprzężonym z lantanowcami jest zatem niższa niż w przypadku większości fluorochromów konwencjonalnie stosowanych w cytometrii przepływowej, a zatem może wpływać na wykrywanie słabo eksprymowanych antygenów.
Cytometrię masową wraz z sekwencjonowaniem pojedynczych komórek stosowano do badania heterogeniczności populacji komórek układu odpornościowego, które dotychczas uważano za stosunkowo jednorodne. Podejście to znalazło zastosowanie w szczególności w badaniach komórek szpikowych, limfocytów T lub wrodzonych komórek limfoidalnych .
Oprócz heterogeniczności komórek, do lepszego scharakteryzowania ontogenezy komórek dendrytycznych zastosowano cytometrię masową. Cytometria masowa umożliwiła również identyfikację podtypu komórek dendrytycznych przyczyniających się do tłumienia nadmiernej odpowiedzi immunologicznej u płodu lub scharakteryzowanie komórek odpornościowych obecnych w ośrodkowym układzie nerwowym myszy oraz określenie zmian związanych ze starzeniem się lub autoimmunizacją ( stosując eksperymentalny mysi model stwardnienia rozsianego).
Wreszcie, cytometrię masową zastosowano do identyfikacji populacji komórek związanych z patologiami, takimi jak celiakia i choroba Leśniowskiego-Crohna oraz w raku nerki.